Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico
Summary
Descriviamo lo sviluppo di un modello murino di PCOS-come magro con pellet di diidrotestosterone per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.
Abstract
Iperandrogenismo svolge un ruolo critico nella funzione riproduttiva e metabolica nelle femmine ed è il segno distintivo della sindrome dell’ovaio policistico. Lo sviluppo di un modello di topo PCOS-come magro che imita le donne con PCOS è clinicamente significativo. In questo protocollo, descriviamo un tale modello. Con l’inserimento di una lunghezza di 4 mm di pellet di polvere DHT (diidrotestosterone) cristallo (lunghezza totale di pellet è di 8 mm), e sostituirlo ogni mese, siamo in grado di produrre un modello del mouse di PCOS-come con piega di 2 livelli DHT siero superiore rispetto ai topi non impiantati con DHT (no-DHT). Abbiamo osservato la disfunzione metabolica e riproduttiva senza modificare il peso corporeo e la composizione corporea. Mentre che esibiscono un alto grado di sterilità, un piccolo sottoinsieme di questi topi femminili PCOS-come può rimanere incinto e la loro prole pubertà ritardata e testosterone aumentato di adulti. Questo modello di mouse magra PCOS-come è uno strumento utile per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.
Introduction
Iperandrogenismo è il segno distintivo della sindrome dell’ovaio policistico (PCOS) secondo criteri NIH e dell’eccesso dell’androgeno e della società PCOS (AE-PCOS). Le donne con PCOS hanno difficoltà a rimanere incinta e hanno un aumentato rischio di complicazioni di gravidanza1. Anche se sono incinta, loro prole femminile hanno un2,di esiti negativi per la salute3. Modelli animali sono stati sviluppati utilizzando varie strategie4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 e che esibiscono molte caratteristiche di PCOS (anovulazione, e o alterata tolleranza al glucosio e insulina) con aumento del peso corporeo e l’obesità associata con ingrossamento degli adipociti dimensioni e il peso maggiore del adipocyte. Esistono due strategie principali per produrre modelli animali che vengono utilizzati per studiare la PCOS. Uno è il trattamento con alti livelli di androgeni direttamente (androgeni esogeni iniezione/inserimento) o indirettamente (ad esempio bloccando la conversione di androgeni in estrogeni con inibitore dell’aromatasi) dopo nascita13. Un altro è di hyperexposure fetale di androgeni durante gestazione14,15 per studiare la prole. Ad esempio, prole femminile da scimmia rhesus16,17, pecore18e roditori esposti a maschi livelli di androgeni durante il periodo intrauterino sviluppare tratti di PCOS-come più tardi nella vita. Questi modelli significativamente migliorato la nostra comprensione degli effetti androgeni e programmazione fetale e uterini effetti ambientali. Tuttavia, questi modelli hanno i loro limiti: 1) gli animali sviluppano obesità e pertanto risulta difficile separare gli effetti di iperandrogenismo da obesità indotta riproduttivo e disfunzione metabolica; 2) prima della gravidanza, le donne con PCOS presentano già alti livelli di androgeni, così gli ovociti sono stati esposti agli androgeni in eccesso prima della fecondazione; 3) le dosi farmacologiche di testosterone (T) o diidrotestosterone (DHT) utilizzato dopo la nascita o durante la gestazione potrebbero non riflettere l’ambiente dell’androgeno di PCOS. Livelli di testosterone e DHT sono stati misurati nel fluido follicolare ovarico e/o del siero, e testosterone ed i livelli di DHT sono 1.5 a 3,9 volte superiore nelle donne con PCOS5,19,20,21 ,22,23 rispetto alle donne inalterate. Abbiamo creato un topo adulto modello23,24,25 che si sviluppa la disfunzione metabolica e riproduttiva entro due settimane dall’inizio dell’esposizione cronica di DHT dall’inserimento di una pallina con lunghezza di 4 mm polvere di cristallo DHT (lunghezza totale di pellet è di 8mm). Questo modello produce livelli DHT del siero che sono circa 2 volte superiore (denominato 2xDHT) di quella dei topi di controllo senza trattamento DHT. I topi di 2xDHT non presentano alterazioni di basale del siero, testosterone, LH e non sviluppare l’obesità e mostrare peso ovarico simile, i livelli sierici di colesterolo, acidi grassi liberi, leptina, TNFα e IL-623,24, 25 relativi a controlli anche fino a 3,5 mesi dopo DHT inserimento23,24,25. Inoltre, con l’accoppiamento le femmine che hanno già sviluppato caratteristiche di PCOS, possiamo studiare l’impatto di un ambiente materno iperandrogenica sulla salute metabolica e riproduttiva della prole15.
Questo nuovo paradigma (pertinente ai criteri NIH e società AE-PCOS) modella la malattia producendo relativamente simili livelli di androgeni a quelli delle donne con PCOS 2 – 3 volte più alto testosterone o i livelli di DHT rispetto alle donne inalterate. Tuttavia, questo modello è garantito dal continuo DHT esogeno e non da iperandrogenismo endogeno programmato una volta DHT è ritirato. L’obiettivo generale di questo articolo è di concentrarsi su 1) come fare il pellet DHT; 2) come generare un lean-PCOS come modello murino; 3) strategie per valutare la prole femminile da queste dighe. Altre misure e la valutazione di fenotipi non vengono affrontati in questo manoscritto, ma possono essere trovati in5,15,23,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Iperandrogenismo è una caratteristica fondamentale di PCOS. I livelli del siero DHT (due volte più alto nei topi DHT che nei topi no-DHT) utilizzati in questo protocollo sono inferiori a quelli riportati da altri ricercatori in studi precedenti e sono calibrati per imitare proporzionalmente le donne con PCOS5,19, 20,21. A differenza di altri modelli, questo modello DHT 2 volte non altera il …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (sovvenzioni R00-HD068130 a S.W.) e il centro di ricerca del diabete di Baltimora: piloti e fattibilità Grant (a S.W.).
Materials
| Crystalline 5α-DHT powder | Sigma-Aldrich | A8380-1G | ||
| Dow Corning Silastic tubing | Fisher Scientific | 11-189-15D | 0.04in/1mm inner diameter x0.085in/2.15mm outer diameter | |
| Medical adhesive silicone | Factor II, InC. | A-100 | ||
| Goggles, lab coats, gloves and masks. | ||||
| 10 µL pipette tips without filter | USA Scientific | 11113700 | ||
| Microscope slide for smear | Fisher Scientific | 12-550-003 | ||
| Diff Quik for staining cells | Fisher Scientific | NC9979740 | ||
| Lancet | Fisher Scientific | NC9416572 | ||
| 3 mL Syring | Becton, Dickinson and Company (BD), | 30985 | ||
| attached needle: 20G | BD | 305176 | ||
| Ruler: any length than 10cm with milimeter scale. | ||||
| Xylazine | Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise | NDC13985-704-10 | 100mg/ml | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira, Inc | NDC 0409-2051-05 | 100mg/ml | |
| Surgical staple | AutoClip® System, Fine Science Tool | 12020-00 | ||
| Insulin syringe | BD | 329461 | 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe | |
| Trochar | Innovative Research of America | MP-182 | ||
| Microscope | Carl Zeiss Primo Star | 415500-0010-001 | Germany | |
| Ear punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | ||
| Testosterone rat/mouse ELISA kit | IBL | B79174 | ||
| DHT ELISA kit | Alpha Diagnostic International | 1940 | ||
| One touch ultra glucometer | Life Scan, Inc. | |||
| One touch ultra test stripes | Life Scan, Inc. | |||
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-18 | ||
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | ||
| Clidox | Fisher Scientific | NC0089321 | ||
| surgical underpad | Fisher Scientific | 50587953 | 
|
|
| Betadine Antiseptic Solution | Walgreens | |||
| 3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) | 3M Science. Applied to Life | |||
| Animal tattoo ink paste | Ketchum manufacturing Inc. | Brockville, Ontario, Canada | ||
| Scale | Ohaus Corporation | HH120D | Pine Brook, NJ | |
| Electronic digital caliper | NEIKO Tools USA | 01407A | available from Amazon |
Referencias
- Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
- Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
- de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , (2018).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
- Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
- Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
- Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
- Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
- Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
- Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
- Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
- Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
- Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS?. Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
- Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
- Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome?. Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
- Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome – a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
- Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
- Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
- Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
- Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
- Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
- Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
- Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
- Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
- van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function?. Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , (2009).
- Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
- Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
- McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
- Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
- Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).
