Oppervlakte-enhanced resonantie Raman verstrooiing nanosonde Ratiometry voor het opsporen van microscopische eierstokkanker via folaat Receptor gericht op

Summary

Eierstokkanker vormen metastasen in de peritoneale holte. Hier presenteren we een protocol te maken en gebruik folaat-receptor gerichte oppervlak-enhanced resonantie Raman verstrooiing nanoprobes dat onthullen van deze letsels met hoge specificiteit via de beeldvorming van de ratiometric. De nanoprobes intraperitoneally zijn toegediend aan levende muizen, en de afgeleide beelden correleren goed met histologie.

Abstract

Eierstokkanker vertegenwoordigt de dodelijkste gynecologic maligniteit. De meeste patiënten presenteren in een vergevorderd stadium (FIGO fase III of IV), wanneer lokale metastatische verspreiden zich al heeft voorgedaan. Echter, ovariale kanker heeft een uniek patroon van metastatische verspreiding, tumor implantaten in eerste instantie zijn vervat in de peritoneale holte. Deze functie kan inschakelen, in principe de volledige resectie van de tumor implantaten met een curatieve intentie. Veel van deze metastatische letsels zijn microscopische, waardoor ze moeilijk te identificeren en behandelen. Neutraliseren van dergelijke micrometastasen wordt verondersteld te zijn een grote doel naar het elimineren van de herhaling van de tumor en het bereiken van voortbestaan op lange termijn. Raman imaging met oppervlakte verbeterde resonantie Raman verstrooiing nanoprobes kan worden gebruikt om af te bakenen microscopische tumoren met hoge gevoeligheid, als gevolg van hun heldere en bioorthogonal spectrale signatuur. Hier beschrijven we de synthese van twee ‘smaken’ van zo’n nanoprobes: antilichaam-matiemaatschappij een die zich richt op de receptor folaat — overexpressie in veel kanker van de eierstokken — en een niet-gerichte controle-nanosonde, met verschillende spectra. De nanoprobes zijn mede door de overheid gereguleerde intraperitoneally aan Muismodellen van metastatische menselijke ovariële adenocarcinoom. Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Memorial Sloan Kettering Cancer Center. De peritoneale holte van de dieren is operatief blootgesteld gewassen en gescand met een Raman-microphotospectrometer. Vervolgens de Raman handtekeningen van de twee nanoprobes zijn ontkoppelde met behulp van een algoritme voor de montage van klassieke kleinste kwadraten, en hun respectievelijke scores verdeeld zodat een ratiometric signaal van folaat-gerichte over irrelevante sondes. Op deze manier worden de microscopische uitzaaiingen gevisualiseerd met hoge specificiteit. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat de lokale applicatie in de peritoneale holte — die kan gemakkelijk worden gedaan tijdens de chirurgische ingreep — tumoren kunt labelen zonder de patiënt te onderwerpen aan de systemische nanoparticle blootstelling. Valse positieve signalen die voortvloeien uit niet-specifieke binding van de nanoprobes op viscerale oppervlakken kan worden geëlimineerd door een ratiometric aanpak te volgen waarin gerichte en niet-doelgerichte nanoprobes met verschillende Raman handtekeningen worden toegepast als een mengsel. De procedure is momenteel nog beperkt door het ontbreken van een commerciële breed-gebied Raman imaging camerasysteem, waarmee één keer beschikbaar voor de toepassing van deze techniek in de operationele theater.

Introduction

Raman imaging met ‘Oppervlakte verbeterde Raman verstrooiing’ (SERS) nanodeeltjes heeft aangetoond grote belofte in uitgezet laesies in een verscheidenheid van instellingen en voor vele verschillende tumor type^1,2,3,4 . Het belangrijkste voordeel van SERS nanodeeltjes is hun vingerafdruk-achtige spectrale signatuur, bieden ze onbetwistbaar opsporen die niet door biologische achtergrond signalen⁵is verward. Bovendien, de intensiteit van het uitgezonden signaal wordt verder versterkt met het gebruik van verslaggever moleculen (kleurstoffen) met absorptie maxima in overeenstemming met de excitatie-laser, die aanleiding geven tot het ‘oppervlakte verbeterde resonantie Raman verstrooiing’ (SERRS) nanodeeltjes met nog grotere gevoeligheid^{6,7,8,9,10,11,12}.

Een barrière die moet worden aangepakt voor de aanneming van SE(R)RS nanodeeltjes¹³ en vele andere nanoparticle constructies^14,15 voor klinisch gebruik is hun wijze van toediening, zoals intraveneuze injectie systemische veroorzaakt blootstelling van de agent, en vereist uitgebreide testen als u wilt uitsluiten van mogelijke bijwerkingen. In dit artikel presenteren wij een ander paradigma gebaseerd op de toepassing van nanodeeltjes lokaal in vivo, direct in de peritoneale holte tijdens chirurgie, gevolgd door een wassen stap voor verwijderen van een niet-afhankelijke nanodeeltjes¹. Deze aanpak is in overeenstemming met de nieuwe therapeutische benaderingen die momenteel onderzochte waardoor ook gebruik van een lokale toediening van agenten in de peritoneale Holte, genaamd hyperthermic intraperitoneaal chemotherapie (HIPEC). Aldus, het principe zelf moet zijn relatief eenvoudig te integreren in een klinische werkstroom. We hebben het ook van de nanodeeltjes onderzocht na intraperitoneale toediening, en eventuele detecteerbare absorptie in de systemische circulatie¹niet in acht genomen. Daarnaast omzeilt de lokale toepassing aanpak de inbeslagneming van nanodeeltjes door het reticuloendotheliaal-systeem, dus de nummers van nanodeeltjes vereist zijn aanzienlijk verminderd. Echter, wanneer toegepast topicaal, antilichaam-matiemaatschappij nanodeeltjes neiging te houden op de viscerale oppervlakken zelfs in de afwezigheid van hun doel. Oog op het minimaliseren van valse positieve signalen als gevolg van niet-specifieke nanoparticle hechting, wij streven naar een benadering van de ratiometric, waar een moleculair gerichte nanosonde zorgt voor het specifieke signaal en een niet-gerichte controle-nanosonde, met verschillende Raman spectrum, accounts voor niet-specifieke achtergrond^16,17. We hebben aangetoond dat deze methode van topisch toegepast oppervlakte verbeterde resonantie ratiometric Ramanspectroscopie onlangs in een muismodel van diffuse eierstokkanker¹.

Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van twee SERRS nanoprobes, een gerichte en één niet-specifieke, moeten lokaal worden toegepast in muismodellen, om het beeld van de prevalentie/overexpressie van kanker gerelateerde biomerker met behulp van ratiometric detectie van de twee sondes via Raman imaging. In dit werk, werd de folaat receptor (FR) gekozen als de doelgroep, zoals dit een upregulated van de markering in vele ovariële kanker^{18,19 is}. Raman microimaging met nanodeeltjes SERS gebaseerde is ook aangetoond voor kanker cel identificatie²⁰. Twee verschillende “flavors” van Raman nanodeeltjes worden gesynthetiseerd, elk die haar vingerafdruk voortvloeien uit een verschillende organische kleurstof. De nanodeeltjes bestaan uit een ster-vormig gouden kern omgeven door een silica omhulsel en tonen oppervlakte plasmon resonantie op ongeveer 710 nm. De verslaggever Raman (organische kleurstof) wordt gelijktijdig met de vorming van silica shell gestort. Ten slotte is de silica shell voor de FR-gerichte nanoprobes (αFR-NPs) geconjugeerd met antilichamen, overwegende dat de niet-gerichte nanoprobes (nt-NPs) zijn gepassiveerd met een enkelgelaagde van polyethyleenglycol (PEG).

Deze techniek werd met succes gebruikt om de kaart van microscopische tumoren in een muismodel van xenograft van diffuse metastatische ovariale kanker (SKOV-3), demonstreren de toepasbaarheid ervan voor in vivo gebruik. Het kan ook worden uitgebreid voor gebruik in het verwijderde weefsel, voor tumor fenotypering of marge vaststelling na debulking zoals in een cognaat studie²¹.

SERRS nanoprobes zorgen voor een robuust platform voor het creëren van meerdere gerichte labels voor biomarkers, gesynthetiseerd met eenvoudige chemische reacties, zoals schematisch aangegeven in Figuur 1. Hier presenteren we het protocol voor de synthese van de twee soorten SERRS nanoprobes (secties 1-3), de ontwikkeling van een geschikt eierstokkanker muismodel (punt 4), het beheer van nanoprobes en beeldvorming (sectie 5) en ten slotte de data-analyse en Visualisatie (punt 6).

Protocol

Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Memorial Sloan Kettering Cancer Center (#06-07-011). 1. gouden Nanostar Core synthese Opmerking: Gouden nanostars worden gebruikt als kernen voor beide smaken van de SERRS nanoprobes gebruikt in dit experiment. 800 mL van 60 mM ascorbinezuur (C6H8O6) oplossing in gedeïoniseerd water (DI) en 8 mL van 20 mM te…

Representative Results

Oog op kwaliteitscontrole kan de nanodeeltjes worden gekarakteriseerd met behulp van een verscheidenheid van methoden tijdens het proces van synthese, met inbegrip van TEM, Distributielijsten, nanoparticle bijhouden analyse en UV/Vis Absorptie spectroscopie, zoals weergegeven in Figuur 2. Op deze manier de grootte van de kern van de gouden nanostar (beschreven in sectie 1), de vorming van de silica …

Discussion

Voorziet het protocol beschreven hier instructie voor de synthese van twee “flavors” van SERRS nanoprobes, en hun werkgelegenheid in muizen Raman imaging van ovariële tumor overexpressing de Receptor van folaat, een ratiometric algoritme gebruikt. Het belangrijkste voordeel van Raman imaging over andere optische beeldvormende technieken (zoals fluorescentie) is de hoge specificiteit van het nanosonde signaal dat niet kan worden verward met alle signalen van biologische oorsprong. In deze belichaming van Raman imaging, w…

Materials

Name of Reagent
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
3-MPTMS	Sigma-Aldrich	175617
Ammonium hydroxide (28%)	Sigma-Aldrich	338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]	AbCam	ab3361
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous)	Sigma-Aldrich	276855
Ethanol	Sigma-Aldrich	792780
IR140	Sigma-Aldrich	260932
IR780 perchlorate*	Sigma-Aldrich	576409	Discontinued*
Isopropanol	Sigma-Aldrich	650447
N.N.Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
PEG crosslinker	Sigma-Aldrich	757853
PEG-maleimide	Sigma-Aldrich	900339
Tetrachloroauric Acid	Sigma-Aldrich	244597
Tetraethyl Orthosilicate	Sigma-Aldrich	86578
*IR792	Sigma-Aldrich	425982	*Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO)	ThermoFIsher	87724
Centrifugal filters	Millipore	UFC510096
inVia confocal Raman microscope	Renishaw
MATLAB (v2014b)	Mathworks
PLS Toolbox (v8.0)	Eigenvector research