Hippo Luciferase tabanlı büyük tümör baskılayıcı (Latı) biyoalgılayıcı kullanarak yolu etkinliğini sinyal izleme
Summary
Burada büyük tümör baskılayıcı (Latı) kinaz aktivitesinin ölçmek için bir luciferase tabanlı biyoalgılayıcı mevcut-Merkez kinaz yolu sinyal Hippo içinde. Bu biyoalgılayıcı temel ve translasyonel araştırma Hippo yol regülatörleri vitro ve in vivoaraştıran yönelik çeşitli uygulamalar vardır.
Abstract
Yol sinyal Hippo organ boyutu korunmuş bir Regülatörü ve geliştirme ve kanser biyolojide önemli rolleri vardır. Teknik sorunlar nedeniyle bu sinyal yolu etkinliğini değerlendirmek ve biyolojik bağlamında yorumlamak zor kalır. Büyük tümör baskılayıcı (Latı) varolan edebiyat nitel ve kolayca ölçekli-up can’t tarama yöntemlerini kullanır. Son zamanlarda, su aygırı kinaz cascade Latı bir çekirdek bileşenidir kinaz etkinliğini izlemek için bir bioluminescence tabanlı biyoalgılayıcı geliştirdik. Burada, biz nasıl bu Latı biyoalgılayıcı (Latı-BS) su aygırı yol regülatörleri karakterize etmek için kullanılan yordamları açıklar. İlk olarak, biz ayrıntılı bir protokol (Örneğin, VEGFR2) bir overexpressed protein aday etkisini araştıran için Latı-BS kullanarak Latı faaliyete sağlar. O zaman, biz nasıl Latı-BS-ebilmek var olmak kullanılmış için bir küçük ölçekli kinaz inhibitörü ekran göster. Bu protokolü feasibly ölçekli-up şüphesiz Hippo yolun roman düzenleyiciler tanımlayacak daha büyük ekranlar gerçekleştirmek için olabilir.
Introduction
Hippo sinyal yolu ilk hücre büyümesi ve hayvan boyutu1,2yeni bir düzenleyici Drosophila içinde tanımlanmıştır. Onun ilk keşif beri montaj kanıt inandırıcı Hippo yol geliştirme (Örneğin, erken embriyonik gelişme, organ boyut kontrolü ve üç boyutlu [3-b] morfoloji), kritik rol oynar göstermiştir tumorigenesis () Örneğin, tümör gelişimi, metastaz, anjiogenez, bağışıklık kaçırma, genomik istikrarsızlık, stres tepkisi ve ilaç direnci) ve doku homeostasis (Örneğin, kök hücre yenileme ve farklılaşma ve doku rejenerasyonu yaralanma sonra) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. su aygırı sinyal olduğunu sık sık çeşitli kanserlerin7,8,9,10,11,12dysregulated. Bu nedenle, işlevleri ve tedavi ve rejeneratif tıp kanser biyoloji Hippo döngüsünün elucidating sıcak yerlerindendir Biyomedikal araştırma olmuştur.
Buna kısa, ters yönde düzenleyiciler (Örneğin, hücre-hücre iletişim, besin stres ve hücre dışı matriks [ECM]), tarafından etkinleştirme üzerine su aygırı yolu içinde MST1/2 (MST; Drosophila Hippo memeli homologs) (S/T) serin/treonin kinaz fazdan/harekete geçirmek adaptör protein hMOB1 ve WW45, hem de olan, daha sonra transkripsiyon Co aktivatörü YAP ve onun paralog korunmuş HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidin; TAZ fazdan LATS1/2 (Latı) kinaz R, arginin; K, lizin; S, serin; T, treonin; X, herhangi bir amino asitler) motifleri, YAP-S127 ve TAZ-S8911,12de dahil olmak üzere. S127 fosforile YAP (YAP-pS127) ve S89 fosforile TAZ (TAZ-pS89) ubiquitination tarafından bozulmuş veya sitoplazmik protein 14-3-3 bağlama ve TEAD1-4 transkripsiyon faktörleri aşağı transactivate çekirdeği ile etkileşim engellenir genler hücre çoğalması ve Apoptozis (Şekil 1). Hippo yolu büyük ilgi rağmen Hippo sinyal ölçme kaç araç var ve bu da tarihsel olarak YAP/TAZ/TEAD transkripsiyon çıkışı gazetecilere sınırlı olmuştur. Gerçekten de, yakın zamana kadar vardı dinamikleri ve bileşenleri bir nicel, gerçek zamanlı, yüksek üretilen iş ve non-invaziv bir şekilde sinyal Hippo etkinliğini ölçmek için bir araç yoktur vitro ve içinde vivo.
Bizim protein-protein etkileşimleri fizyolojisi ve patoloji rolünün anlaşılmasını ortaya çıkan göz önüne alındığında, bu etkileşimler bir nicel ve gerçek zamanlı bir şekilde13eğitim için kullanılan araçları geliştirilmesi büyük ilgi olduğunu, 14,15,16. Nitekim, Maya iki-hibrid (Y2H)17, yüzey plasmon rezonans (SPR)18ve Förster rezonans enerji transferi (FRET)19 deneyleri de dahil olmak üzere biyo-analitik stratejileri geliştirilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, protein-protein etkileşimleri değerlendirmek için. Ancak, öyle ki birçok yapıları verimli bir bulmak için test edilmesi gereken bu yaklaşımlardan önemli optimizasyon muhabir yönünün gerektiren sınırlaması taşırlar. Daha fazla, öyle ki gerçek bir olumlu sinyal yüksek beklentileri karşılayan zor olabilir bu yaklaşımlar da nispeten düşük sinyal-gürültü oranı var.
Protein uluslara deneyleri bu sınırlamalarının üstesinden gelir için geliştirilmiştir. Protein uluslara deneyleri ilk nesil üzerinde bölünmüş çok renkli floresan proteinler dayanıyordu ve yukarıda belirtilen sınırlamalar20çözmek değil. Çok renkli floresan proteinler düşük benzeşme ve arka plan gürültü21ile iki ayrı istikrarlı parçalara bölüp önlemek üzere yalnızca bir etki alanı oluşur. Daha sonra ateş böceği luciferase bölünmüş protein uluslara deneyleri gelişmekte olan kullanım için yeni bir aday olarak tespit edilmiştir. Bu yaklaşım, iki parçaları (N-terminal ve C-terminal luciferase [NLuc ve CLuc]) ilgi için bir hedef protein erimiş her parçası ile ateş böceği luciferase ayrılır. İki hedef proteinler arasındaki etkileşimin üzerine yakınlık içine NLuc ve CLuc getirdiysen luciferase etkinliği yeniden düzenlendi ve kollarındaki ışık biyoluminesans substrat ve ATP22huzurunda oluşturulur. 2001 yılında yaparak NLuc ve CLuc parçaları içeren kitaplığı kullanarak bir birleşimsel tarama çeşitli sitelerde kesme ve proteinler için farklı halkalı ile bağlı, Paulmurugan ve Gambhir Stanford Üniversitesi’nde geliştirilen en iyi duruma getirilmiş bir split-ateş böceği protein-protein etkileşimleri23luciferase tamamlayıcı parçası destekli sistem. Bu sistemde, amino asit (aa) NLuc ve CLuc, faiz sekiz glisin kalıntılarının esnek bir bağlayıcı kullanarak iki protein için eklenen forma 398 ve iki serin artıkları ateş böceği luciferase kesilir.
Benzer bir yaklaşım kullanarak, biz son zamanlarda yeni bir Latı BS NLuc 15’e eritme tarafından geliştirilen Latı fosforilasyon sitede S127 çevreleyen YAP, aa (YAP15) ve CLuc ile 14-3-3. Tam uzunlukta YAP protein, YAP (Örneğin, diğer siteler ve ubiquitination fosforilasyon) post-translational modifications tarafından diğer ters yönde düzenleyiciler tarafından sinyalleri semptomlarıdır önlemek için kullanılmadı. Burada sunulan Latı-BS non-invaziv içinde vitro canlı hücreler içinde ve in vivo fareler20,24 (Şekil 2) içinde iki etkinlik sinyal Hippo izleyebilirsiniz. Burada, biz Latı kinaz aktivitesi vitro Latı-BS kullanarak ölçmek için detaylı bir protokol tanımlamak. İlk olarak, Latı-BS overexpressed bir protein Latı etkinliği üzerindeki etkisini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Sonra biyoalgılayıcı Hippo yolu etkinliğini Hippo yolu düzenleyen ajanlarla tedavi sonrasında izlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu iletişim kuralı tanımlamak ve sinyal yolları veya Latı kinaz aktivitesi düzenleyen uyaranlara karakterize etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hippo yolu çeşitli biyolojik süreçleri kritik rol oynar ve kanser6için bozukluk Hippo yolu açar iken, nasıl su aygırı yolu çeşitli uyaranlara yanıt olarak düzenlenmiştir tamamen anlaşılamamıştır. Ayrıca, çekirdek Hippo bileşenleri etkinliğini değerlendirmek için hiçbir nicel ve gerçek zamanlı sistem olmuştur. Son zamanlarda, geliştirilen ve Latı kinaz aktivitesi Hippo yolu24ölçmek için bir roman biyoalgılayıcı doğrulanmış. Bu biyoalg?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe–dan Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (CIHR #119325, 148629) tarafından desteklenen ve XY için Kanada meme kanseri Vakfı (CBCF). TA Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs ve Ontario Uluslararası Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenir. HJJVR Kraliçe Elizabeth II yüksek lisans burs bilimi ve teknolojisi tarafından desteklenir.
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
Referencias
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
