عزل خلايا CD4+ خلايا تي و "تحليل لتعميم" مساعد تي الحبيبي (كتفه) "خلية مجموعات فرعية" من 6-لون "الدم الطرفية استخدام التدفق الخلوي"
Summary
هنا، على بروتوكول لعزل وتوصيف CD4+ تي خلية هو وصف مجموعات فرعية من الدم المحيطي البشري. تنقية خلايا CD4+ خلايا تي يتم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي لتحديد نسب تي جرابي الخلية مساعد مجموعات فرعية.
Abstract
نشاط الخلية مساعد (طفح) T جرابي الشاذة يمكن اكتشافها في الظروف الذاتية ويرتبط وجودهم بالنتائج السريرية عندما يتم تحليل المكروية العقدة الليمفاوية في الأورام اللمفاوية الخلية ب غير-هودجكين. مجموعات فرعية من تعميم مساعد تي جرابي الخلايا (كتفه)، حجرة الذاكرة المتداولة طفح الخلايا في الدم، وهي أيضا قلق في المرض، وتمثل بالتالي المؤشرات الحيوية التنبؤية رواية المحتملة. اختبار الطرفية المستندة إلى الدم مفيد لأنه نسبيا غير الغازية ويتيح رصد المسلسل بسيطة. توضح هذه المقالة طريقة لعزل خلايا CD4+ خلايا تي من الدم البشري، ومزيد من التحليل بقياس التدفق لتعداد الخلايا كتفه ونسب على مجموعات فرعية مختلفة (كتفهبد-1–/+/مرحبا، cTfh1، 2 و 17 و cTfh1/17). ثم مقارنة مع مستوى هذه المجموعات الفرعية بين المواضيع العادية والمرضى بسرطان الغدد اللمفاوية. وجدنا أن الأسلوب كانت قوية بما يكفي للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها من المواد التي تم جمعها بشكل روتيني المريض. الأسلوب الذي يصف لنا للتحليل يمكن تكييفها بسهولة لفرز الخلايا والمتلقين للمعلومات من تطبيقات مثل RT-PCR.
Introduction
تي جرابي مساعد الخلايا (طفح) هي خلايا CD4+ تي خلية فرعية التي تميزت في البداية في الأنسجة اللمفاوية1. هذه الخلايا التعبير عن PD-1 ومستقبلات CXCR5 السطحية وتفرز 21 إيل وايل-4، وإظهار التعبير النووية عامل النسخ، BCL-62،3. وكما يوحي اسمها، أنها توجد في مراكز جيرمنال وضرورية ل إنتاج الأجسام المضادة عالية تقارب1.
طفح Dysregulated الردود قد تورطت في إمراضية المرض، وأهمها أمراض المناعة الذاتية، حيث أنها تعزز توسيع نطاق من الخلايا أوتوريكتيفي ب4. كما أنها تلعب دوراً في ورم المكروية الصلبة5،6 والسرطانات اللمفاوية7. على العكس من ذلك، تعمل العيوب الوراثية من البروتينات السطحية ضرورية لطفح مثل تي خلية إيندوسيبلي كوستيمولاتور (نظام ايكوس) ينتج من متلازمات نقص المناعة البشرية8. خلايا CD4+ CXCR5+ الخلايا في الدم المحيطي البشري توصف بتعميم تي جرابي مساعد الخلايا (كتفه) ويعتقد أن تكون حجرة الذاكرة طفح الخلايا في الأنسجة9. وغرض الأسلوب الموصوفة هنا هو تحليل لمجموعات فرعية كتفه أثر CD4+ خلية العزلة من عينات الدم المحيطية.
وتم تحديد عدة مجموعات فرعية في كتفه والكفاءة التي يقدمونها مساعدة ب-الخلية يختلف عن مجموعة فرعية واحدة إلى آخر9،10،،من1112. يتم تغيير الارتفاع النسبي لهذه المجموعات الفرعية في عدد من الأمراض، ومعظم أمراض المناعة الذاتية مكاناً بارزا فيها هناك دائماً تقريبا زيادة نسبية في أكثر وظيفية PD-1+ مرحبا و/أو مجموعات فرعية cTfh2 أو cTfh17 بالمقارنة مع الأقل الفنية PD-1– و/أو مجموعات فرعية cTfh112. كثيرا ما ربط مدى هذه التغيرات مع المعلمات السريرية بما في ذلك مرض النشاط والأجسام التتر، مما يشير إلى دور محتمل لتوزيع فرعية كتفه كالعلامات البيولوجية تنبؤاتها في المرض، مما قد يعكس نشاط طفح في الأنسجة اللمفاوية9،12،،من1314. بالإضافة إلى ذلك، أخذ عينات دم من المشاركين سريعة ومأمونة ومقبولة، وتسمح بذلك المسلسل رصد لتحليل تطور المرض أو استجابة للعلاج.
استخدام خلايا CD4 المعزولة+ خلايا تي على تعليق خلية وحيدات النوى (ببمنك) الدم المحيطي التقليدية يتيح ارتفاع صافي التدفق الخلوي التجارب بتقليل الوقت المطلوب للحصول على عدد كبير من الخلايا كتفه للتحليل. وهذا مفيد بشكل خاص عند فرز الخلايا من كتفه النادرة مجموعات فرعية باستخدام تدفق تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). للمعونة الكفاءة، يمكن أن cryopreserved هذه المعلقات لتمكين “الخلط” العينات لاستخدامها في تجربة التدفق الخلوي. في الاختبار، خلايا CD4+ نقاء بمقدار لم نعد.
في حين قدمت مختبرات مختلفة تستخدم علامات مختلفة لتصنيف الخلايا كتفه في المراحل الأولى للاكتشاف، الأسلوب هنا يجعل استخدام نظام موحد لمجموعتين من علامات سطح الخلية كما اقترحه شميت وآخرون12، 15 لتمكين تحديد المتزامن من كتفه وعلى مجموعات فرعية المعترف بها تسعة في قياس تدفق واحد التجربة.
كما تستخدم علامات سطح خلية فقط، لا تتطلب التثبيت أو بيرميبيليزيشن الخلايا، ومما يمكن أن تبقى على قيد الحياة للدراسات الفنية المتلقين للمعلومات. وهذا يمكن أن تيسره الخلية الفرز باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية مع نفس الفريق الضد. ويمكن توسيع هذا الفريق لتشمل علامات أخرى، السماح للقيود المفروضة على سيتوميتير تدفق قيد الاستخدام.
تحليل تجارب قياس التدفق متعدد الألوان يمكن أن تكون صعبة نظراً لطبيعة طبيعتها الذاتية النابضة في مؤامرات دوت ثنائي الأبعاد، لا سيما عندما السكان خلية لا تملك توزيعاً واضحا ثنائية مشروط في الأسفار ماركر، كما هو الحالة للخلايا كتفه وعلى مجموعات فرعية. ولهذا السبب، من الضروري إعداد ضوابط فعالة للحد من المصنوعات اليدوية لتمكين دقة أفضل للسكان ولتعيين النابضة استراتيجيات ثقة. على هذا النحو، جسم فريق تصميم وإقامة الضوابط الأساسية لقياس تدفق التجربة، أي استخدام التعويض وضوابط FMO مبينة في خطوة 3.4.2 و 3.4.3,respectively.
يتم تعريف كافة كتفه الخلايا كخلايا CD4+ CXCR5+ CD45RA–. يمكن تحديد مستوى التعبير علامة التنشيط طفح مميزة PD-1 ثم تحديد مجموعات فرعية من PD-1–، PD-1+ أو PD-1مرحبا كتفه الخلايا. ثم، باستخدام مزيج من مستقبلات تشيموكيني CXCR3 و CCR6، التي يعبر عنها خلطات Th1 التقليدية، 2 أو 17 من الخلايا، كتفه يمكن أن يوصف cTfh1، 2 أو 17 الشبيهة بنبذة عن CXCR3+ CCR6–، CXCR3– CCR6– ، و CXCR3– CCR6+، على التوالي.
يتم عرض لوحة الأضداد المستخدمة من قبل المختبر في الجدول 1. قد يكون المستخدم التكيف مع اختيارهم fluorophore مراعاة لليزر وتكوين تصفية الضوء المتاحة في سيتوميتير تدفق المحلية على.
الاعتبارات التالية التي تؤثر في الاختيار فلوروفوريس. استخدام fluorophores مشرق حيثما كان ذلك ممكناً. على وجه الخصوص، استخدام ألمع fluorophores متاح على العلامات الأكثر خفوت (أعرب أقل شدة). وتشمل علامات باهتة PD-1 و CXCR3 و CCR6، وإلى حد أقل، CXCR5. ونحن على وجه التحديد استخدام الأحدث BB وبي وبوب فلوروفوريس التي توفر سطوع ممتازة، وبالتالي تمكين القرار أسهل من السكان متميزة من الخلايا.
تنتشر التحديد fluorophore عبر أطياف الانبعاثات بقدر الإمكان للتقليل من التداخل الطيفي، ومن ثم مستوى التعويضات المطلوبة. يمكن العثور على أداة مجانية على الإنترنت التي يمكن استخدامها للمساعدة في تصميم لوحة قياس تدفق هنا: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. لتوفير مساحة على طيف الانبعاث، استخدمنا “قناة تفريغ” باستخدام صبغة بقاء مع الطول موجي انبعاثات التي تتداخل مع آسيا والمحيط الهادئ-H7 (يضاف إلى CD45RA) لتمكين الكشف (والإقصاء) من كلا الميت و/أو CD45RA+ باستخدام كشف واحد.
هنا، يرد بروتوكول لعزل الدم المحيطي CD4+ خلايا تي وتحليلها لاحقاً بالتدفق الخلوي لتحديد نسب مختلفة ووصفت ذلك مؤخرا تعميم مجموعات فرعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمثل هذا البروتوكول بطريقة بسيطة وفعالة لتحليل خلايا الدم المحيطية كتفه، وتمكين الكشف عن جميع المجموعات الفرعية ذات الصلة المحددة في الأدب حتى الآن. عينات الدم ويمكن بسهولة وكفاءة الحصول كما يمكن جمع جزء من العيادات الخارجية القياسية وعينات المسلسل بالتوازي مع البيانات السريرية. بدوره…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد الأعمال منحة من سرطان الدم المملكة المتحدة ETB ومجا.
Materials
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
Referencias
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin’s lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
