Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement
Summary
Ici, un “workflow” pour la culture et la gène analyse de l’expression des cellules endothéliales sous la contrainte de cisaillement fluide est présenté. Inclus est un arrangement physique pour simultanément du logement et la surveillance des chambres de flux multiples dans un environnement contrôlé et l’utilisation d’un ARN exogène référence pour PCR quantitative.
Abstract
Nous décrivons un flux de travail pour l’analyse de l’expression des gènes des cellules endothéliales sous réserve d’un flux laminaire régulier à l’aide de plusieurs chambres à flux surveillés de plaques parallèles. Les cellules endothéliales forment la paroi cellulaire interne des vaisseaux sanguins et sont exposés de façon chronique à la force de frottement de la circulation sanguine appelée contrainte de cisaillement. Dans des conditions physiologiques, la fonction de cellules endothéliales en présence de diverses conditions de contrainte de cisaillement. Ainsi, l’application des conditions de la contrainte de cisaillement dans des modèles in vitro peut fournir une meilleure compréhension de réponses endothéliales in vivo. La chambre à plaques parallèles flow précédemment publiée par Lane et al. 9 est adapté pour étudier la régulation génique endothéliale en présence et en absence de stable à flux laminaire (non pulsatile). Principales adaptations dans la mise en place pour un écoulement laminaire tel que présenté ici incluent un grand environnement dédié aux circuits de flux simultanés de maison, la surveillance des débits en temps réel et l’inclusion d’une référence exogène RNA pour la normalisation de données quantitatives de PCR en temps réel. Afin d’évaluer plusieurs traitements/conditions de l’application de la contrainte de cisaillement, plusieurs circuits de circulation et les pompes sont utilisées simultanément dans le même incubateur chauffé et humidifié. Le débit de chaque circuit d’écoulement est mesuré en continu en temps réel pour normaliser les conditions de la contrainte de cisaillement au cours des expériences. Parce que ces expériences ont plusieurs conditions, nous utilisons également un ARN exogène de référence qui est dopé au moment de l’extraction de l’ARN pour la normalisation de l’extraction de l’ARN et l’efficacité de la synthèse de cDNA de premier-brin. Ces mesures réduire la variabilité entre les échantillons. Cette stratégie est employée dans notre pipeline pour l’analyse de l’expression génique avec des expériences de la contrainte de cisaillement à l’aide de la chambre à plaques parallèles flow, mais certaines parties de cette stratégie, tels que l’exogène référencent RNA spike-dans, peuvent facilement et économiquement être utilisés pour autres applications.
Introduction
Les cellules endothéliales vasculaires forment la paroi cellulaire interne des vaisseaux sanguins dans le système cardiovasculaire fermé des espèces supérieures. Ils forment l’interface entre le sang et les tissus et sont caractérisés par luminale et abluminal surfaces. L’endothélium est un système diversifié et actif adaptatif qui régule la circulation sanguine, traite des éléments nutritifs, l’immunité et la croissance du sang neuf navires1. Dans le corps, les cellules endothéliales présentent normalement dans un environnement où ils sont exposés à la force de frottement de la circulation, la contrainte de cisaillement2. Contrainte de cisaillement est un régulateur important de cellules endothéliales gene expression3, et les cellules endothéliales essaient de conserver la contrainte de cisaillement dans une plage donnée2,4. Les cellules endothéliales démontrent angiogénique patterning en l’absence de contrainte de cisaillement5 qui peuvent améliorer la perfusion tissulaire. Les modèles régionaux de flux perturbé et altéré la contrainte de cisaillement sont associées à l’expression des gènes inflammatoires6 et le développement de l’athérosclérose7,8. Ainsi, les modèles qui incluent la contrainte de cisaillement sont une composante majeure de la compréhension de la régulation génique endothéliale.
Nous décrivons une méthode pour étudier la régulation des gènes dans les cellules endothéliales vasculaires sous la contrainte de cisaillement. Ce système utilise des flux non pulsatile et imite fluide des contraintes de cisaillement et de la concentration d’oxygène cela État de modèle pour les cellules endothéliales artérielles. Ce protocole comprend les détails des méthodes pour la précipitation de gène à l’aide de l’interférence ARN (ARNi), la mise en place pour l’application de la contrainte de cisaillement à l’aide de l’appareil à plaques parallèles flux et méthodes pour la pointe d’une référence exogène RNA avant l’analyse par réaction en chaîne polymérase quantitative de transcriptase inverse (RT-qPCR). Cet oléoduc est utilisé pour l’étude de la régulation génique dans les cellules endothéliales en présence et en absence de contraintes de cisaillement laminaires et comprend une adaptation de l’appareil à plaques parallèles flux décrit par Lane et al. 9. cette configuration particulière a été conçue pour faciliter l’évaluation simultanée de multiples conditions expérimentales qui permet une comparaison directe des conditions de la contrainte de cisaillement, ainsi que la normalisation de l’analyse de la RNA. Une grande unité chauffée avec humidité contrôlée est utilisée pour permettre à plusieurs chambres de flux séparé et pompes s’exécute simultanément avec des débits surveillés pour chaque ensemble de chambre de flux en temps réel. L’application de cette mise en place est utilisée pour la précipitation de gène à l’aide d’Arni dans le cadre du flux laminaire/cisaillement, mais aspects du présent protocole peuvent être appliquées à toute évaluation de l’expression des RNA.
Des approches communes pour l’application de la contrainte de cisaillement pour les cellules endothéliales incluent de systèmes microfluidiques10un viscosimètre cône et plaque11et un flux de plaques parallèles chambre12. Les systèmes microfluidiques provenant de divers fabricants ont été utiles dans l’étude mécanobiologie et mécanotransduction dans plusieurs cellules et types de tissus et une variété de stimuli biophysiques. Pour les cellules endothéliales, ils ont été utilisés pour étudier les cellules endothéliales en isolement, ainsi que l’interaction des cellules endothéliales et le trafic d’immunitaire ou tumeur de cellules10. Toutefois, ces systèmes sont moins appropriés pour la récupération d’un grand nombre de cellules9. Le viscosimètre cône-et-plaque et chambres à plaques parallèles débit permettent la récupération d’un grand nombre de cellules en monocouches confluentes12. Ces systèmes peuvent générer une chaîne de cisaillement forces et tendances12. L’écoulement de plaques parallèles chambre Assemblée9 a l’avantage de cette imagerie en temps réel peuvent être effectuées par le biais de la fenêtre de verre afin d’évaluer la morphologie cellulaire à tout moment. En outre, le perfusat peut être recueilli dans des conditions stériles. Pour le système présenté ici, le flux peut être également surveillée en temps réel et dans une structure multichambre, qui facilite le maintien des conditions de cisaillement entre les chambres.
Pour des expériences représentatives, cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui représentent un type de cellules endothéliales macrovasculaires, sont utilisés, et les conditions de contrainte de cisaillement que nous utilisons (1 Pa) reflètent des conditions artérielles (0,1 – 0,7 Pa). Toutefois, ce protocole peut être utilisé avec d’autres types de cellules endothéliales et les conditions de contrainte de cisaillement peuvent être ajustées selon la question expérimentale. Par exemple, l’évaluation des cellules endothéliales humaines dans des conditions qui modélisent la circulation veineuse nécessiterait des niveaux inférieurs de la contrainte de cisaillement (1-6 Pa) et des études qui modélisent la circulation microvasculaire ont utilisé des niveaux de contrainte de cisaillement de 0,4 – 1,2 Pa13 , 14. en outre, la contrainte de cisaillement peut varier même entre les cellules endothéliales dans les vaisseaux sanguins idem6. Dans la configuration actuelle, on utilise un système de surveillance unique qui peut surveiller simultanément les quatre boucles de flux séparé. Pour les laboratoires qui ont besoin de plusieurs boucles de flux, il y a l’espace dans l’environnement dédié pour un système de surveillance supplémentaire.
RT-qPCR est utilisé pour la quantification absolue d’expression des gènes dans le cadre de la contrainte de cisaillement. L’expression relative des gènes de cible est souvent utilisée pour comparer l’expression RNA dans l’ensemble des conditions. Certaines espèces d’ARN peut exister à très faibles quantités ou être absent, ce qui complique les mesures relatives. Par exemple, ARN long non codantes dans les cellules endothéliales peut exercer des effets puissants au nombre relativement faibles copies par cellule5. En outre, des différences dans l’efficacité de l’apprêt peuvent conduire à une interprétation erronée d’utiliser la méthode delta-delta de seuil (Ct) cycle pour analyser les données. Pour apaiser cette inquiétude, nous effectuons une quantification absolue en générant une courbe d’étalonnage à l’aide d’une quantité connue d’ADN plasmidique. En outre, synthèse de l’ADN (cDNA) complémentaire est un processus inefficace, et différences dans l’efficacité de l’ADNc peuvent tenir compte des différences dans l’expression de RNA entre conditions et entre échantillons15. L’application de la contrainte de cisaillement et/ou réactifs de transfection peut influer sur la viabilité, la prolifération cellulaire et l’apoptose, ou ajouter des composants qui peuvent interférer avec la synthèse de l’ARN l’isolation et/ou l’ADNc. Pour tenir compte de la possibilité de partialité de l’isolement et la synthèse de cDNA, nous utilisons un épi RNA contrôle synthétisés dans le laboratoire, a ajouté au moment de l’extraction de l’ARN et mesuré avec chaque cDNA synthèse via RT-qPCR. Cela permet non seulement de l’ajustement technique des différences dans la synthèse de l’ARN extraction et ARNC, mais permet aussi le calcul des quantités absolues par cellule, lorsque le nombre d’éléments est connu.
Ce système utilise des étapes supplémentaires pour maintenir la similitude ou de tenir compte des différences techniques entre les conditions. Nous insistons particulièrement sur ces étapes en raison de la nature complexe de ces expériences, qui impliquent de multiples configurations physiques et des conditions expérimentales qui peuvent conduire à la variabilité expérimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrainte de cisaillement est un état physiologique qui module la fonction endothéliale, en partie, en affectant l’équilibre gene expression2,5. Modèles de régulation génique dans diverses conditions de contrainte de cisaillement contribuera à une meilleure compréhension de la fonction endothéliale. Ce flux de travail pragmatique inclut un circuit d’écoulement à l’aide d’une chambre à plaques parallèles flux adaptée de Lane et al. …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les IRSC MOP 142307 de p.a.M. H.S.J.M. est un bénéficiaire d’un programme en Regenerative Medicine Fellowship des instituts de recherche en santé du Canada formation. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. et M.K.D. sont destinataires de la Reine Elizabeth II bourses d’études supérieures dans les sciences et la technologie.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
Referencias
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