Stres birden çok paralel-plaka akışı Chambers kullanarak yamultmak için maruz endotel hücrelerinin gen ifade Analizi
Summary
Burada, sıvı kesme stres altında endotel hücre kültür ve gen ifade analizi için iş akışı gösterilmektedir. Dahil aynı anda konut ve kontrollü bir ortamda ve eksojen başvuru RNA kullanım kantitatif PCR için birden çok akış odalarında takibi için fiziksel bir düzenlemedir.
Abstract
Gen ifadesinin birden çok izlenen paralel-plaka akışı chambers kullanarak sabit bir laminar akış tabi endotel hücrelerden analizi için bir iş akışı açıklanmaktadır. Endotel hücreleri kan damarlarının iç hücresel astar formu ve kronik kan akışını kesme stres denilen sürtünme kuvveti maruz kalır. Fizyolojik koşullar altında endotel hücreleri işlevi çeşitli kesme stres koşulları huzurunda. Böylece, vitro modelleri kesme stres koşullarında uygulanması endotel yanıt içinde vivoiçine daha fazla fikir sağlayabilir. Daha önce Lane ve ark. tarafından yayınlanan paralel-plaka akışı odası 9 sabit (pulsatil olmayan) laminer akış de endotel gen düzenlemesi çalışmaya adapte olduğunu. Kurulum laminar burada sunulan akış için anahtar uyarlamalar house eşzamanlı akış devreleri, akış oranları izleme büyük, kendini işine adamış ortamına dahil gerçek zamanlı ve bir eksojen başvurusunu RNA normalleşme için dahil nicel gerçek zamanlı PCR veri. Birden çok tedaviler/koşul kesme stres uygulanması ile değerlendirmek için birden çok akış devreler ve pompalar aynı anda aynı ısıtmalı ve oksijen inkübatör içinde kullanılır. Her akış devre debisi sürekli olarak ölçülür deneyler kesme stres koşullarını standartlaştırmak için gerçek zamanlı. Bu deneyler birden çok koşul olduğundan, ayrıca RNA ayıklama zaman RNA çıkarma ve ilk iplikçikli cDNA sentez verimliliği normalleştirme için çivili içinde ki bir eksojen başvuru RNA kullanın. Aşağıdaki adımları değişkenlik örnekleri arasında en aza indirmek. Bu strateji ile paralel-plaka akışı odası kullanarak kesme stres deneyler gen ifade analizi için bizim potansiyel olarak istihdam edilmektedir, ancak eksojen gibi bu stratejinin parçaları spike-RNA içinde başvuru, kolay ve düşük maliyetle kullanılabilir diğer uygulamalar.
Introduction
Vasküler endotel hücreleri daha yüksek tür kapalı kardiyovasküler sistem kan damarlarının iç hücresel astar oluştururlar. Onlar kan ve doku arasında arayüz oluşturmak ve luminal ile karakterizedir ve abluminal yüzeyler. Endotel kan akımı, besin ticareti, bağışıklık ve yeni kan damarları1büyüme düzenleyen farklı, etkin ve edinilmiş bir sistemdir. Vücutta, endotel hücreleri normalde nerede dolaşımı, yamultma stres2sürtünme kuvveti için sunulan bir ortamda adlı biri yok. Yamultma stres endotel hücre gen ifade3önemli bir düzenleyicisidir ve endotel hücreleri kesme stres verilen aralığı2,4içinde korumak deneyin. Endotel hücreleri doku perfüzyon artırabilir kesme stres5 yokluğunda biçimlenme anjiogenik göstermektedir. Bölgesel desen rahatsız akışı ve değiştirilmiş kesme stres inflamatuar genler6 ifade ve ateroskleroz7,8gelişimi ile ilişkili olan. Böylece, yamultma stres içeren endotel gen düzenlemesi anlama önemli bir parçasını modellerdir.
Gen düzenlemesi kesme stres altında vasküler endotel hücrelerde çalışmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sistem pulsatil olmayan kullanır ve sıvı kesme stres düzeyleri ve oksijen konsantrasyonu arteriyel endotelyal hücreler için bu modeli koşulları taklit eder. Bu iletişim kuralı için RNA müdahale (RNAi), kesme spike-in bir eksojen başvurusu RNA Analizi önce tarafından paralel-plaka akışı cihazları ve yöntemleri kullanarak stres uygulanması için set-up kullanarak gen nakavt metodun ayrıntıları içerir ters transkriptaz nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR). Bu boru hattı laminer kesme stres de endotel hücrelerindeki gen düzenlemesi eğitim için kullanılır ve Lane ve ark. tarafından açıklanan paralel-plaka akışı aparatı uyarlaması içerir 9. belirli bu kurulum doğrudan karşılaştırma kesme stres koşulları, hem de RNA Analizi normalleştirme sağlar aynı anda birden çok deneysel koşullar değerlendirilmesi kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Büyük ısıtmalı birimi Kontrollü nem ile birden çok ayrı akışı odalar ve pompaları akış oranları gerçek zamanlı olarak her akış odası derleme için izlenen ile aynı anda çalışması için izin vermek için kullanılmaktadır. Bu kurulum uygulanması gen nakavt RNAi laminar akış/makaslama stres ayarıyla kullanmak için kullanılır, ancak bu protokolü yönlerini RNA ifade herhangi bir değerlendirme için uygulanabilir.
Endotel hücreleri için kesme stres uygulanması için yaygın bir yaklaşım mikrosıvısal sistemleri10, bir koni ve plaka Vikozimetre11ve bir paralel-plaka akışı odası12içerir. Çeşitli üreticilerin mikrosıvısal sistemleri mechanobiology ve mechanotransduction birden çok hücre ve doku tipleri ve biyofiziksel uyaranlara çeşitli eğitim yararlı olmuştur. Endotel hücreleri için bunlar yalıtım yanı sıra arasındaki etkileşimin endotel hücreleri ve bağışıklık veya tümör hücreleri10/ kaçakçılığı endotel hücrelerinde eğitim için kullanılmıştır. Ancak, bu sistemler daha az sayıda hücre9kurtarma için uygundur. Koni ve plaka Vikozimetre ve paralel-plaka akışı chambers konfluent monolayers12hücrelerde çok sayıda kurtarma sağlar. Bu sistemler kesme kuvvetleri ve desenler12bir dizi oluşturabilirsiniz. Paralel-plaka akışı odası derleme9 o gerçek zamanlı görüntüleme avantajı vardır, herhangi bir zaman hücresel morfoloji değerlendirmek için cam pencere aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Ayrıca, perfusate Steril koşullar altında toplanabilir. Burada sunulan sistem için akışını da gerçek zamanlı olarak ve odaları arasında kesme koşulları bakımından kolaylaştıran bir çok odası kurulumu, izlenebilir.
Temsilcisi deneyler için bir tekrarlamışlar endotel hücre türü temsil, insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC), kullanılan ve yamultma stres koşulları kullandığımız (1 Pa) arteryel koşulları yansıtır (0.1 – 0.7 Pa). Ancak, bu iletişim kuralı-ebilmek var olmak kullanılmış ile diğer endotel hücre tipleri ve yamultma stres koşulları deneysel soru göre ayarlanabilir. Örneğin, insan endotel hücreleri venöz dolaşım model koşullarında değerlendirilmesi kesme stres (1-6 Pa) daha düşük düzeyde gerektirecektir ve mikrovasküler dolaşımı model çalışmaları 0.4 – makaslama stres düzeyleri kullanıldığında 1.2 Pa13 , 14. Ayrıca, yamultma stres hatta aynı kan damarı6içinde endotel hücreleri arasında değişebilir. Geçerli kurulumu, tek bir izleme sistemi kullanılır olarak dört ayrı akışı döngü aynı anda izleyebilir. Daha fazla akış döngüler gerekir labs için yer içinde özel çevre için ek bir izleme sistemi.
RT-qPCR kesme stres ayarında Gen ifadesinin mutlak Nefelometri için kullanılır. Hedef genlerin göreli ifade kez RNA ifade koşullar arasında karşılaştırmak için kullanılır. Bazı RNA türleri çok düşük miktarlarda var veya yok, böylece göreli ölçüler karmaşık hale getiren olmak. Örneğin, endotel hücrelerinde uzun kodlamayan RNA’ların nispeten düşük kopya numaralarından hücre5başına güçlü efektleri uygulamak. Buna ek olarak, astar verimliliği farklılıkları yanlış bir yoruma delta delta döngüsü eşik (Ct) yöntemini kullanarak verileri çözümlemek için yol açabilir. Bu endişe adrese, mutlak Nefelometri plazmid DNA bilinen bir miktar kullanarak standart bir eğri oluşturarak gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi verimsiz bir süreçtir ve cDNA verimliliği farklılıkları koşullar arasında örnekleri15arasında farklılıklar RNA ifade için hesap. Yamultma stres ve/veya transfection reaktifler uygulanması hücre çoğalması, apoptozis ve canlılığı etkiler veya RNA izolasyon ve/veya cDNA sentezi ile girişime neden olabilir bileşenleri ekleyin. Önyargı olasılığı için hesap RNA izolasyon ve cDNA sentezi için laboratuarda sentezledim, RNA ayıklama saatinde eklendi ve her cDNA sentez yolu ile ile RT-qPCR ölçülen bir spike RNA denetimi kullanın. Teknik RNA ayıklama ve cDNA sentezi farkları ama aynı zamanda hücre sayısı bilindiğinde mutlak miktarların hesaplanması hücre başına sağlar sadece ayarlama sağlar.
Bu sistem benzerliği korumak veya koşulları arasındaki teknik farklar için hesap için ek adımlar kullanır. Özellikle birden çok fiziksel set-up ve deneysel değişkenlik açabilir deneysel koşullar içeren bu deneyler karmaşık doğası nedeniyle bu adımları vurgulamak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yamultma stres endotel fonksiyonları, kısmen, kararlı durum gen ifade2,5etkileyen tarafından gelen fizyolojik bir durumdur. Gen düzenlemesi çeşitli kesme stres koşullarında modellerinin endotel fonksiyonları daha büyük bir anlayış için katkıda bulunacaktır. Bu pragmatik iş akışı Lane ve ark. uyarlanmış bir paralel-plaka akışı odası kullanarak akış devre içerir 9 ve temsil laminer, pulsatil olmayan ak?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser için Pam. CIHR paspas 142307 tarafından desteklenen H.S.J.M. bir Kanada kurumları, sağlık araştırma eğitim programı rejeneratif tıp kardeşlik bir alıcı olduğunu. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. ve M.K.D. Kraliçe Elizabeth II Lisansüstü Bursları bilim ve teknolojideki alıcıları vardır.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
Referencias
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
