Visualización en tiempo real y análisis de la lesión de condrocitos debido a cargas mecánicas en explantes de cartílago murino intacta

Resumen

Se presenta un método para evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de articulaciones murinas intactas después de la aplicación de cargas mecánicas controladas o impactos. Este método puede utilizarse para investigar cómo osteoartritis, factores genéticos o los regímenes de carga diferentes afectan la vulnerabilidad de los condrocitos en situ .

Resumen

La homeostasis del cartílago articular depende de la viabilidad de las células residentes (condrocitos). Lamentablemente, trauma mecánico puede inducir la muerte de condrocitos generalizada, puede conducir a la ruptura irreversible de la articulación y la aparición de la artrosis. Además, el mantenimiento de la viabilidad de los condrocitos es importante en los procedimientos de injerto osteocondral de resultados quirúrgicos óptimos. Se presenta un método para evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de las articulaciones sinoviales murinas intactas después de la aplicación de cargas mecánicas controladas o impactos. Este método puede utilizarse en estudios comparativos para investigar los efectos de los regímenes de cargas mecánicas diferentes, diferentes condiciones ambientales o manipulación genética, así como diferentes etapas de la degeneración del cartílago en corto o a largo plazo vulnerabilidad de los condrocitos articulares in situ. El objetivo del protocolo presentado en el manuscrito es evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de las articulaciones sinoviales murinas. Importante, este método permite la prueba en el cartílago completamente intacto sin comprometer condiciones nativas. Además, permite la visualización en tiempo real de los condrocitos articulares tinción vital y único análisis basado en imágenes de la lesión celular inducida por la aplicación de static control y regímenes de carga de impacto. Nuestros resultados representativos demuestran que en explantes de cartílago sano, la extensión espacial de la lesión de la célula depende de sensible intensidad de magnitud y el impacto de carga. Nuestro método puede adaptarse fácilmente para investigar los efectos de los regímenes de cargas mecánicas diferentes, diferentes condiciones ambientales o diferentes manipulaciones genéticas de la vulnerabilidad de la mecánica de en situ condrocitos articulares.

Introducción

Cartílago articular (CA) es una tejido que recubre y protege los huesos en las articulaciones sinoviales, proporcionando suave articulación conjunta de carga. Homeostasis del tejido depende de la viabilidad de los condrocitos, el tipo de célula única que reside en la CA. Sin embargo, exposición del cartílago a fuerzas extremas debido al trauma (p. ej., cataratas, lesiones accidente o deportes) o debido a la inestabilidad postraumática de la articulación puede inducir la muerte de condrocitos, conduciendo a la degradación irreversible de la articulación (artrosis) ¹. Además, en osteocondral procedimientos que tienen por objeto reparar l....

Protocolo

Todos los trabajos de animales fue aprobado por el Comité de la Universidad de Rochester sobre los recursos.

1. las soluciones

1. Preparar la solución salina balanceada de Hank (HBSS de X 1) que contiene calcio, magnesio y sin rojo fenol. Ajustar el pH a 7.4 mediante la adición de pequeñas cantidades de HCl o NaOH.
2. Adición de NaCl o agua desionizada para ajustar la osmolaridad a 303 mOsm. Utilizar el búfer durante las disecciones, preparación de muestras y ensayos mecánicos.

2. disección del fémur Distal y húmero Proximal con cartílago Articular intacta

1. Eutanasia el ratón según la....

Resultados

Seis diferentes aplicación protocolos de carga (carga estática: 0.1 N, 0.5 N y 1 N por 5 min; y carga de impacto: 1 mJ y 2 mJ mJ 4) reproducible inducida cuantificables áreas localizadas de lesión celular en el cartílago femoral y humeral obtenido (ratones BALB/c) 8-10 semanas de edad Figura 2). Lo importante es la extensión espacial de la lesión de condrocitos en la superficie articular se midió rápidamente y fácilmente en ImageJ. Resultados representativos .......

Discusión

Los métodos descritos anteriormente se emplearon con éxito para visualizar viable y heridos o muertos en situ condrocitos articulares de las articulaciones del ratón después de prescribir cargas mecánicas o impactos. En particular, hemos sido capaces de analizar la vulnerabilidad mecánica de condrocitos en el cartílago articular intacta de dos articulaciones sinoviales diferentes: la articulación de la rodilla (fémur distal) y hombro (Húmeros). Nuestros resultados representativos muestran que la extensión espaci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Calceína, AM	Invitrogen de Thermo Fisher Scientific	C3100MP	20x50mg , Eugene, OR, USA
Yoduro de propidio	Invitrogen de Thermo Fisher Scientific	P3566	1 mg/mL solución en agua, 10mL, Eugene, OR, USA
Dimethyl sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	1L DMSO, anhidro, ≥ 99.9%, St. Louis, MO, EE. UU.
HBSS (calcio, magnesio, sin rojo fenol)	Gibco by Thermo Fisher Scientific	14025-092	1X, 500 ml, Grand Island, NY, EE. UU
Cuchilla quirúrgica de plumas (#11)	VWR	102097-822	Hatfield, PA, EE. UU
Osmómetro de presión de vapor, VAPRO	ELITechGroup	Modelo 5520	Puteaux, Francia
Medidor de pH	Modelo Beckman	Phi 32	Brea, CA, EE. UU.
Termomezclador Eppendorf	Eppendorf AG	Modelo 5350	Hamburgo, Alemania
Microscopio de investigación invertido motorizado	Olypmus	Modelo IX-81	Center Valley, PA, EE. UU.
Aplicador de madera	Puritan Medical Products Company, LLC	807	6"x100, Guilford, ME, EE. UU.
1.5 Cubreobjetos de vidrio	Warner Instruments, LLC	64-1696	#1.5, 0.17 mm de grosor, 40 mm de diámetro, Hamden, CT, EE. UU.

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