Echtzeit-Visualisierung und Analyse der Knorpelzelltransplantation Verletzungen aufgrund der mechanischen Belastung in völlig intakt murinen Knorpel Explantaten
Summary
Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Arthrose, genetische Faktoren und/oder verschiedenen laden-Therapien die Verwundbarkeit der in Situ Chondrozyten auswirken.
Abstract
Homöostase der Gelenkknorpel hängt die Lebensfähigkeit der ansässigen Zellen (Chondrozyten). Leider kann mechanische Trauma weit verbreitete Knorpelzelltransplantation Tod, möglicherweise führend zu irreversiblen Ausfall des Gelenks und der Beginn der Arthrose auslösen. Darüber hinaus ist die Wartung der Knorpelzelltransplantation Rentabilität wichtig osteochondrale Transplantation Verfahren für optimale chirurgische Ergebnisse. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen synovialen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann in vergleichenden Studien verwendet werden, um zu untersuchen, die Auswirkungen der unterschiedlichen mechanischen Belastungen Regimen, verschiedenen Umweltbedingungen oder genetische Manipulationen sowie verschiedenen Stufen der Knorpel-Degeneration auf kurz- bzw. langfristigen Anfälligkeit von in-situ artikuläre Chondrozyten. Das Ziel des Protokolls eingeführt in das Manuskript soll die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche der murinen synovialen Gelenke zu beurteilen. Wichtig ist, ermöglicht diese Methode testen auf völlig intakte Knorpel ohne native Randbedingungen. Darüber hinaus ermöglicht es Echtzeit-Visualisierung von entscheidender gefärbten artikuläre Chondrozyten und einzelne Image-basierte Analyse der Zelle Verletzung durch Anwendung der kontrollierten statisch und Auswirkungen laden Therapien induziert. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass im gesunden Knorpel Explantaten die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung Ausmaß und die Auswirkungen der Belastungsintensität sensibel abhängt. Unsere Methode kann leicht angepasst, um die Auswirkungen der unterschiedlichen mechanischen Belastungen Regimen, verschiedenen Umweltbedingungen oder verschiedenen genetischen Manipulationen auf die mechanischen Anfälligkeit von in Situ artikuläre Chondrozyten zu untersuchen sein.
Introduction
Gelenkknorpel (AC) ist eine tragende Gewebe, das bedeckt und schützt Knochen in synovialen Gelenke, eine reibungslose gemeinsame Artikulation. Gewebe-Homöostase ist abhängig von der Lebensfähigkeit der Chondrozyten, der einzige Zelltyp mit Wohnsitz in AC. Jedoch kann Exposition des Knorpels zu extremen Kräfte aufgrund Trauma (z.B., fällt, Fahrzeug-Unfall oder Sport-Verletzungen) oder Post-traumatische Gelenkinstabilität Knorpelzelltransplantation Tod, führt zu irreversiblen Ausfall des Gelenks (Arthrose) induzieren. 1. Darüber hinaus in osteochondrale Transplantation Verfahren, die darauf abzielen, lokale Defekte in Knorpelschäden zu reparieren, Transplantat einfügen-assoziierten mechanische Trauma reduziert Knorpelzelltransplantation Lebensfähigkeit und hat nachteilige Auswirkungen auf die chirurgischen Ergebnisse2.
Knorpel Explant Modelle werden häufig verwendet, um die Anfälligkeit der Gelenkknorpel Chondrozyten mechanisch induzierte Zelltod zu studieren. Diese Modelle verwenden in der Regel Explantaten von großen Tieren Studie zu den Auswirkungen des Ladens Bedingungen, Umgebungsbedingungen und anderen Faktoren auf Zelle Schwachstelle3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Diese Modelle erfordern jedoch aufgrund der Größe der native Gelenke, in der Regel Entfernung eines Steckers aus der Gelenkfläche ein intaktes Gelenk, dabei Kompromisse bei der nativen Randbedingungen. Darüber hinaus ist sie in der Regel großen mechanischen Belastungen auf Zelle Verletzung zu induzieren. Alternativ bieten murinen Knorpel Explant Modelle mehrere Vorteile gegenüber größeren Tiermodellen bei der Untersuchung der mechanischen Anfälligkeit der in Situ Chondrozyten. Diese Modelle erleichtert vor allem aufgrund ihrer kleineren Abmessungen, Prüfung von voll intakten Gelenkknorpel ohne nativen Gewebe Integrität zu verändern. Darüber hinaus laden der murinen Knorpel erfolgt über kleine Kontaktflächen, sodass Knorpelzelltransplantation Tod/Verletzung mit kleinen Lasten induziert werden kann (< 1 N). Schließlich ist die Maus Genom leicht manipuliert und ermöglicht Tests wie bestimmte Gene Auswirkungen die Anfälligkeit in Situ Chondrozyten gegen mechanische Verletzungen.
Das übergeordnete Ziel der Methode eingeführt, in diesem Manuskript ist zu quantifizieren und visualisieren-in real-time-die räumliche Ausdehnung der in Situ Zelle Tod/Verletzungen durch mechanische Belastungen auf völlig intakt Maus Knorpel-Knochen explants in Vitro. Diese Methode erfordert sorgfältige Präparation der Maus synovialen Gelenke ohne Kompromisse bei der Knorpelzelltransplantation Lebensfähigkeit, gefolgt von mechanische Prüfung von äußerst gefärbten Explantaten mit einem Mikroskop montierte Gerät ähnlich wie eine Testplattform, die wir vor kurzem entwickelt murine Knorpel mechanischen Eigenschaften16zu quantifizieren. Während mechanische Prüfung, ist ein Großteil der (intakt) Gelenkfläche des Knochens seziert sichtbar auf einem einzigen Fluoreszenz Schliffbild, ermöglicht schnelle Analyse der Zellviabilität, nachdem eine Last angewendet wird. Eine ähnliche Analyse der Oberfläche Zellviabilität in murinen Knorpel Explantaten wurde zuvor, aber ohne gleichzeitige Anwendung der Last17durchgeführt. Mögliche Anwendungen unserer Methode sind vergleichende Studien untersuchen die Verwundbarkeit der Gelenkknorpel Chondrozyten an verschiedenen kontrollierten Umwelt- und mechanischen sowie Screening von Behandlungen, die zur Verringerung der Empfindlichkeit der Chondrozyten auf mechanische Belastung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die oben beschriebenen Methoden wurden erfolgreich eingesetzt, um tragfähige und verletzten/Toten in Situ artikuläre Chondrozyten aus Maus Gelenke nach mechanischen Belastungen oder Auswirkungen vorgeschrieben zu visualisieren. Insbesondere konnten wir die mechanischen Anfälligkeit der Chondrozyten innerhalb voll intakten Gelenkknorpel aus zwei verschiedenen synovialen Gelenke zu analysieren: das Kniegelenk (distalen Oberschenkelknochen) und Schulter (Humeri). Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass di…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. Richard Waugh und Luis Delgadillo danken für die großzügige Verwendung von ihre pH-Meter und XR. Darüber hinaus möchte die Autoren Andrea Lee danken für Ihren Beitrag an die anfängliche Entwicklung der mechanischen Testsystem. Diese Studie wurde von NIH P30 AR069655 finanziert.
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
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