Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick
Summary
Descrevemos os métodos para a rotulagem fluorescente de tangencialmente migração células por eletroporação e para a imagem latente de lapso de tempo do movimento de célula rotulada em uma cultura de montagem plana a fim de visualizar a migração celular comportamento no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento .
Abstract
Imagem de lapso de tempo é um método poderoso para analisar o comportamento de migração celular. Após a célula fluorescente rotulagem, o movimento das células em cultura etiquetados pode ser gravado sob microscopia de vídeo. Para a análise de migração celular no cérebro em desenvolvimento, fatia cultura comumente é usada para observar a migração celular paralela à seção de fatia, tais como migração celular radial. No entanto, informação limitada pode ser obtida o método de cultura de fatia para analisar a migração celular perpendicular à seção de fatia, tais como migração celular tangencial. Aqui, apresentamos os protocolos para Time-Lapse de imagens para visualizar a migração celular tangencial no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento. Uma combinação de célula rotulagem por eletroporação no ovo e uma cultura de montagem plana subsequente na inserção da cultura de célula permite a detecção de movimento de células migratórias no plano horizontal. Além disso, nosso método proporciona detecção de comportamento de célula individual e a ação coletiva de um grupo de células a longo prazo. Potencialmente, este método pode ser aplicado para detectar a alteração sequencial da fluorescente-etiquetadas microestrutura, incluindo o alongamento axonal no deslocamento de tecidos ou células neural nos tecidos não-neurais.
Introduction
O estudo da migração celular tem sido progredindo com a técnica de avançada de imagem ao vivo. Após a célula fluorescente rotulagem, o movimento temporal de pilhas etiquetadas em um prato de cultura ou na vivo pode ser gravado sob microscopia de vídeo. No estudo do desenvolvimento neural, foram analisadas as mudanças morfológicas da migração de células ou alongando axônios utilizando imagens de lapso de tempo. Para a imagem latente eficaz, é essencial para aplicar um método adequado para a preparação de rotulagem e tecido fluorescente célula, baseado sobre a finalidade do experimento e análise. Para analisar a migração celular no cérebro em desenvolvimento, fatia cultura tem sido comumente usada para observar a migração celular paralela à seção de fatia, como célula radial migração1,2,3. O sistema de cultura de fatia é também utilizado para detectar células tangencial migração4,5, mas não é adequado para análise direcional em casos onde as células se dispersar perpendicular à seção de fatia.
O tectum óptica é composta de uma estrutura de várias camada, formada pela migração radial e tangencial celular durante o desenvolvimento embrionário. Formação de camada tectal depende, principalmente, migração radial de células postmitotic neuronal precursor da zona ventricular, e seu destino final nas camadas correlaciona-se com sua data de nascimento na zona ventricular6. Quanto a migração tangencial, relatamos anteriormente dois fluxos de migrações nas camadas intermediária e superficiais em um desenvolvimento tectum óptica de garota. Nas camadas médios durante E6 E8, as células bipolares com um processo de tempo principal e um processo à direita fino migram dorsalmente ou ventralmente ao longo do fascículo axônio de axônios eferentes tectal executados dorso-ventralmente7. Após esta migração de axophilic, as células se diferenciar em neurônios multipolares localizados nas camadas profundas. Nas camadas superficiais durante E7-E14, as células migratórias dispersarem-se horizontalmente através da reforma de um processo principal ramificado e dispersão em múltiplas direções8. Após a migração de dispersão, as último células eventualmente se diferenciar em neurônios superficiais de várias morfologias. Em ambos os casos, uma cultura de plano de montagem é eficiente para observar o movimento da célula paralela à superfície pial.
Aqui, apresentamos um protocolo para Time-Lapse de imagens para visualizar a migração celular tangencial no desenvolvimento garota tectum óptica7,8. Combinação de célula rotulagem por eletroporação no ovoe uma cultura de montagem plana subsequente na inserção da cultura de célula permite a detecção de direção de movimento e migração de células migrando. O objetivo desse método é facilitar a detecção de comportamento ambos célula individual o longo prazo e a ação coletiva de um grupo de células no plano horizontal.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito acima é otimizado para a detecção de migração celular em camadas superficiais6,8. É aplicável para a detecção de camada média migração córregos (filme 5),6,7, só pelo momento da eletroporação (5.5 a e 4.5) e o início da cultura de movimento e imagem (E7.0 a E6.0).
O procedimento apresentado é composto de …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo número de concessão de KAKENHI JSPS 15K 06740 para Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
Referencias
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