Summary
在这里, 我们提供了一个协议, 其中包括全面的指导, 经济地建立小鼠对象定位和新的对象识别行为测试, 包括设计, 成本, 和建设所需的设备, 以及执行行为测试、数据收集和分析。
Abstract
与伦理相关的行为测试是任何利用小鼠模型研究各种生理或病理变化的认知效应的研究的关键组成部分。目标定位任务 (olt) 和新的目标识别任务 (nort) 是两种有效的行为任务, 通常用于揭示记忆中特定大脑区域的功能和相对健康。虽然这两项测试都利用了老鼠固有的偏好, 即揭示以前遇到的物体的记忆, 但 olt 主要评估空间学习, 这在很大程度上依赖于海马活动。相反, nort 评估对象身份的非空间学习, 它依赖于多个大脑区域。这两项任务都需要一个开放的现场测试场、与老鼠具有同等内在价值的物体、适当的环境线索以及视频录制设备和软件。商业上可用的系统虽然方便, 但成本可能很高。这份手稿详细介绍了一种简单、经济高效的方法, 用于建造竞技场和设置执行 olt 和 nort 所需的设备。此外, 手稿描述了一个高效的测试协议, 该协议结合了 olt 和 nort, 并提供了典型的数据采集和分析方法以及代表性的结果。成功完成这些测试可以为了解各种鼠标模型系统的内存功能提供有价值的见解, 并评估支持这些功能的潜在神经区域。
Introduction
有效的认知测试通过检查受控环境中的行为来隔离和评估特定大脑区域的神经功能1。在人类中, 专门的任务被设计用来评估目标大脑区域的性能, 例如威斯康星州的前额肌卡分类任务或剑桥神经心理测试自动电池 (cantab) 用于海马功能2,3。这些测试旨在通过评估这些区域的神经活动所产生的行为来研究人类特定大脑区域的功能。大多数生物医学研究的最终目标是改善人类健康;然而, 许多关于大脑在健康或疾病中功能的研究不能与人类参与者进行道德上的研究。对于不能使用人类参与者的研究, 老鼠等小老鼠往往是首选的模型。使用小鼠模型可以直接控制实验操作, 包括改变基因表达, 诱导伤害, 甚至通过光遗传技术调节电路活动。小鼠行为测试, 类似于人类测试, 旨在通过测量依赖于特定区域的行为来评估实验变量对大脑功能的影响。
海马体是人类和啮齿类动物记忆形成的重要结构.更具体地说, 海马体在涉及关系表示的陈述记忆中起着关键的作用, 但不依赖于大脑的运动中心的程序记忆.海马记忆功能是神经科学许多领域研究的热点, 因为它对扰动非常敏感。负扰动范围从长期的压力和老化到癫痫发作和中风与海马损伤5有关。相反, 积极的干预, 如社会交往、物质环境丰富或运动, 可以改善海马功能6、7、8。啮齿类动物的研究对海马记忆进行了适当的测试, 可以揭示对记忆的细胞和分子介质的洞察, 以及不同环境干预对海马功能的影响。
在啮齿类动物中, 已经开发了几项测试来研究海马依赖的学习和记忆9,10,11。它们可以大致细分为需要刺激情绪的任务, 以引起行为的改变, 以及利用啮齿类动物偏好来研究新的刺激11的任务.上下文恐惧情况, 例如, 对不愉快的刺激 (脚冲击) 与环境上下文, 然后通过测量恐惧引起的冻结行为9,11以后测试记忆为上下文。莫里斯水迷宫和它的干燥对应物巴恩斯迷宫, 使用负外部增强, 以促进空间学习4,11。在每一种情况下, 啮齿类动物都会寻求摆脱厌恶的境地, 分别沉浸在冷水中或暴露在光线充足的平台上。相反, 径向臂迷宫依靠正强化, 因为动物使用自然觅食行为加上空间记忆来检索小食物奖励4,11。这些任务被广泛使用, 并已产生有关海马记忆的基础知识。然而, 消极和积极的外部增强或恐惧诱发刺激, 如休克添加到这些行为测试的情感成分, 这在某些情况下可能是不可取的。例如, 背侧和腹侧海马与不同的功能, 空间记忆与情绪调节, 分别为 12。如果腹侧海马情绪调节功能也受到影响, 那么依赖于刺激情绪反应的测试可能无法准确反映受损的空间记忆。
olt 是一个简单而有效的测试, 提供了海马依赖性空间记忆13的测量.这项任务依赖于动物对新颖性的内在偏好, 而无需额外的外部强化, 因此通常可以避免与不同的情绪反应13相关的并发症13。目前的 olt 协议是为小鼠提出的, 但如果适当地缩放设备的尺寸, 它对大鼠也是有效的。该协议包括将鼠标适应一个开放的现场测试场, 然后允许它调查与空间环境线索有关的2个对象。然后将鼠标从竞技场中删除, 并在延迟期间 (审判间隔或 iti), 其中一个对象被移动。在 iti 之后, 鼠标被重新引入竞技场, 并允许自由探索。一般来说, 老鼠更喜欢新奇, 如果他们从最初的接触中记住物体的位置, 他们会花更多的时间去调查移动的物体。海马病变的动物的空间语境学习受损, 因此在新的位置14, 15 对物体没有偏好。
olt 可以独立使用, 也可以与利用来自多个大脑区域的神经活动的额外记忆测试结合使用, 即新的物体识别任务 (nort)。nort 与 olt 相同, 直到测试阶段, 其中一个对象被一个新对象替换, 而不是移动到新位置。与 olt 的情况一样, 对物体有良好记忆的老鼠会自发地更喜欢研究新的物体。与严重依赖海马底物的对象位置记忆不同, 物体识别记忆似乎依赖于大脑的各种区域, 海马体的参与也不稳定。许多研究报告说, 海马病变或失活并不影响新的对象偏好10,13,16, 17, 而其他人发现相反的18,19.然而, 评价啮齿类动物的一般记忆功能仍然是一项常用的任务。
此处介绍的协议描述了启动和执行 olt 和 nort 所涉及的步骤, 这两个步骤都使用开放式现场测试场。商业上可用的行为测试设备成本过高, 尤其是对于较小的实验室而言。该协议包括设计和简单的步骤, 以最低的成本, 没有专门的工具在内部建造竞技场。此外, 该协议还详细介绍了理想的行为测试领域, 包括竞技场的放置、上下文提示和视频录制系统, 为 olt 和 nort 协议的实施奠定了基础。介绍了成功和有缺陷的研究的代表性结果, 强调了优化每项研究的所有材料和程序的重要性。
| 描述 | 选项 | 数量 |
| a 部分: 丙烯酸片-不透明白色 (0.635 厘米 x 40 厘米 x 4064 厘米) | 路由边缘 | 2 |
| b 部分: 丙烯酸片-不透明白色 (0.635 厘米 x 40 厘米 x 41.91 厘米) | 路由边缘 | 2 |
| c 部分: 丙烯酸片-不透明白 (0.635 厘米 x 41.91 厘米 x 41.91 厘米) | 路由边缘 | 1 |
| 丙烯水泥 (1 磅) | 那 | 1 |
| 16量规型喷射器 | 那 | 1 |
| 组合广场 | 那 | 1 |
| 高清网络摄像头 | 那 | 1 |
| 视频采集软件 | 那 | 1 |
| usb 2.0 扩展电缆 | 那 | 1 |
| 电缆管道 | 那 | 1 |
表 1: 行为测试所需材料和设备的明细表。
Protocol
以下协议已获得俄亥俄州立大学 (osu) 动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。
1. 建造竞技场
- 订购表 1中列出的材料: 5 片丙烯酸、丙烯酸水泥和16g 型压机。
- 按照制造商的说明佩戴适当的安全设备, 其中可能包括眼睛、皮肤和其他类型的保护。
- 从丙烯酸片中取出保护纸涂层。
- 干装所有材料, 以确认尺寸是否正确 (图 1a)。
- 用丙烯酸水泥组装并装载注射器。
- 将外墙 (b 部分) 的长边与底座 (c 部分) 的顶部边缘对齐, 并使用组合或机械师正方形确保它们彼此垂直。
- 使用注射器, 将一个小的、稳定的水泥珠直接涂在被连接的两个部分的角落。
- 将两个部分 (b 和 c 部分) 保持在适当的位置, 直到它们最初设置 (大约 5分钟)。
注: 通常情况下, 它们将在24小时内硬化 80%, 但组件可以在5分钟后继续。 - 重复步骤1.5–1.7 与另一个外墙 (b 部分) 到同一基地。
- 使用步骤1.5–1.7 将两个内壁 (a 部分) 一次连接到底座。
- 此外, 使用注射器将一个小而稳定的水泥珠直接涂在由外墙 (b 部分) 和内壁 (a 部分) 形成的角落。
- 将这些碎片固定在适当的位置5分钟。
- 在24-48小时后, 继续设置行为测试环境。
2. 建立行为测试环境和设备
- 将环境提示 (如讨论部分所述) 彼此放在一起, 并面向测试区域中的竞技场 (图 1b)。
- 以 2比1 2 的方式在地板上或坚固的桌子上, 在与提示和相机的适当距离上安排四个测试场地, 以最大限度地提高对鼠标的视觉输入 (图 1 b)。
- 使用从墙上的每个竞技场地板支撑的仪表棒验证视线, 以确认竞技场和线索之间的这些距离是适当的。
- 通过调整摄像机的高度或表格的高度, 确定允许对所有四个竞技场进行视频文档记录的最佳光学路径长度。(图 1 b)。
- 将相机连接到 usb 扩展电缆。
- 使用电缆赛道, 将电缆穿过天花板, 沿着一堵墙运行到运行视频捕获软件的计算机上。
- 将将测试区域中的老鼠与研究人员分开的窗帘后面的计算机隐藏起来 (图 1c)。
- 组装4个至少3个不同的对象, 这些物体的长度和宽度约为2-5 厘米, 高度可达10厘米, 用于测试 (图 1d)。
图 1: 行为测试准备.(a) 现场测试竞技场总成, a 部分对应内壁, b 部分作为外墙, c 部分作为基础。完成的竞技场将有两个外墙 (b 部分) 运行基座的整个边缘和两个内墙 (a 部分), 适合在基座相邻边缘 (c 部分) 的外墙之间。所有的墙都将停留在基座的顶部。(b) 在0.62 米高的桌子、60 x 90 厘米的环境线索、灯光和测试区的摄像机上有代表性地安排竞技场, 以便同时拍摄所有四个竞技场。(c) 在试验期间, 窗帘将实验者和计算机系统隐藏在小鼠身上。为了拍这张照片, 头顶上的灯已经亮了, 但在测试过程中, 只有落地灯亮着。另外, 测试区域的这张照片中的一个环境提示已经被删除, 但在测试过程中, 竞技场前还有第四个提示, 面对桌子后面的所有黑色提示。(d) 适合于小鼠的 olt 或 nort 测试的代表性物体 (和刻度标尺)。请点击这里查看此图的较大版本.
- 验证这些对象。
- 在将使用的实验小鼠的性别、菌株和年龄组中, 至少获得8只野生类型小鼠 (例如, 6 至9只周龄的雌性和雄性 c57bl伯格)。
- 在测试前3-5天内, 每天处理所有小鼠1分钟。
- 把老鼠分成4组, 如果还没有单独安置, 就把它们转移到单独干净的笼子里。
- 把他们带到考场, 让他们适应至少 3 0分钟。
注: 实验者在房间里呆上30分钟将减少实验者在任务期间对小鼠的压力, 特别是如果实验者是男性20分钟。 - 适应完成后, 实验者准备开始, 开始录制视频。
- 将每只鼠标放在竞技场一个角落的墙壁上 (称为释放角) (图 2a)。
- 让老鼠自由探索竞技场10分钟。
- 停止录制视频。
- 将老鼠送回干净的笼子, 持续20分钟。
- 使用动物设施推荐的清洁方法清洁所有竞技场, 例如在下一次使用前使用70% 的乙醇擦拭, 以最大限度地减少嗅觉暗示。
- 使用双面胶带, 在2个非释放角附近贴上2个不同的对象, 使物体在竞技场中得到平衡, 并在该角的每面墙上分别固定 6 x 6 厘米 2 (图 2b)。
- 开始录制视频。
- 将每只鼠标面向释放角的墙壁放置。
- 允许老鼠自由地调查竞技场和物体10分钟。
- 停止录制视频。
- 将老鼠放回干净的笼子里, 持续20分钟。
- 用动物设施推荐的清洁方法清洁所有竞技场和物品, 如用70% 乙醇擦拭, 以最大限度地减少嗅觉暗示。
- 对贴在同一位置的2个新对象重复训练试验, 直到使用每个鼠标测试了所有对象 (如果同时执行 olt 和 nort, 则至少有三个不同的对象)。
- 排除允许鼠标坐在对象顶部的对象。
- 根据步骤4分析每个对象的每个鼠标的调查时间。
- 排除具有负或正内在价值的对象。
3. 进行行为测试
- 测试前一周: 熟悉进行行为测试的个人
- 在检测前3-5天内, 每天处理6至9周岁的成年雌性和雄性 C57Bl/6 小鼠, 时间为1分钟。
- 第1天: 习惯会议
- 把老鼠分成4组, 如果还没有单独安置, 就把它们转移到单独干净的笼子里。
- 把他们带到试验室, 让他们适应试验室至少 3 0分钟。
注:实验者在房间里呆上30分钟将减少实验者在任务期间对小鼠的压力, 特别是如果实验者是男性20分钟。
- 适应完成后, 实验者准备开始, 开始录制视频。
- 将每只鼠标放置在竞技场中 (每个竞技场一只鼠标), 面向释放角的墙壁 (图 2 a)。
- 让老鼠自由探索竞技场6分钟。
- 停止录制视频。
- 在试验间 (iti) 期间, 将小鼠送回干净的笼子。
- 用动物设施推荐的清洁方法清洁所有竞技场, 比如用 7 0% 的乙醇擦拭, 以尽量减少嗅觉暗示。
- 重复步骤 3.3-3.9 两次, 每只鼠标总共有3次适应会话。
- 把所有的老鼠都送回他们的家笼子里。
- 使用动物设施推荐的清洁方法清洁所有竞技场, 如用70% 的乙醇擦拭, 以尽量减少第二天使用前的嗅觉暗示。
- 第2天: 训练试验, olt, nort
注: nort 是可选的测试。- 24小时后, 将同一群老鼠带到试验室, 让它们像前一天的习惯会议前那样, 到试验室至少呆上 3 0分钟。
- 使用放置在竞技场中的2个对象进行培训试验 (图 2b)。
- 使用双面胶带, 将物体从2个非释放角贴上 6 x 6 厘米 2, 使其在竞技场中得到平衡。
- 开始录制视频。
- 将每只鼠标放在释放角的墙壁上, 就像在适应过程中所做的那样。
- 允许老鼠自由地调查竞技场和物体10分钟。
- 停止录制视频。
- 将老鼠放回干净的笼子里, 进行20分钟的 iti。
- 用动物设施推荐的清洁方法清洁所有竞技场和物品, 如用70% 乙醇擦拭, 以最大限度地减少嗅觉暗示。
- 执行 olt。
- 将训练试验中使用的对象之一移动到一个新的非释放角, 并用双面胶带将对象从该角的每面墙贴出6厘米 (图 2c)。
注: 另一个对象应保持在训练试验期间的位置。 - 开始录制视频。
- 将每只鼠标面向释放角的墙壁放置。
- 允许老鼠对物体进行10分钟的调查。
- 停止录制视频。
- 将老鼠放回干净的笼子里, 进行20分钟的 iti。
- 用动物设施推荐的清洁方法清洁所有竞技场和物品, 如用70% 乙醇擦拭, 以最大限度地减少嗅觉暗示。
- 将训练试验中使用的对象之一移动到一个新的非释放角, 并用双面胶带将对象从该角的每面墙贴出6厘米 (图 2c)。
- 执行 nort。
- 将 olt 期间未移动的对象替换为新对象, 并将距离拐角两壁6厘米的新对象与双面胶带贴出 (图 2d)。
- 开始录制视频。
- 将每只鼠标面向释放角的墙壁放置。
- 允许老鼠对物体进行10分钟的调查。
- 停止录制视频。
- 把老鼠放回家里的笼子里。
- 使用动物设施推荐的清洁方法清洁所有竞技场和物品, 如用70% 乙醇擦拭, 以最大限度地减少下一次使用前的嗅觉暗示。
图 2: 用于试验的竞技场配置.(a) 没有对象的开放式测试场。黑色箭头表示释放角。这个角落应该是每个竞技场中的相同的相对位置, 对于每一个被测试的鼠标和每一个试验都是一致的。(b) 在训练试验中, 两个不同的物体被固定在离各自墙壁 6 x 6 厘米的空地上。(c) 对于 olt, 一个物体被移动到一个新的位置, 也距离墙壁 6 x 6 厘米, 而不是释放角。(d) 对于 nort, 在 olt 中静止的对象被一个新颖的对象替换, 而从 olt 移动的对象现在是熟悉的对象。请点击这里查看此图的较大版本.
4. 分析行为测试数据
注: 视频分析最好由至少两名独立的、盲目的实验者完成。
- 打开视频文件。
- 应用一个透明的圆圈, 在屏幕上的每个对象周围提供2厘米的边框, 以帮助确定活动调查。使用视频文件图像, 并将标尺放置在竞技场中, 以校准此网格。
- 观察鼠标行为并记录鼠标主动调查对象的时间, 该对象由其鼻子指向距离该物体最大距离2厘米的对象组成。
- 记录鼠标开始调查对象的时间戳和停止调查该对象时的时间戳。
- 在试用期内, 对竞技场中的两个对象重复此操作。
- 通过减去每个对象调查实例的停止时间的开始时间, 并添加所有这些值, 计算鼠标调查每个对象的累积时间。
- 使用以下公式计算总调查时间的百分比或歧视指数:
- 计算总调查时间的百分比 =
注: 超过50% 的值表示对新位置或对象的更大调查。 - 计算歧视指数 =
注: 正值表示有更多的时间来调查新对象。区分指数为零表示两个对象所花费的时间相等。
- 计算总调查时间的百分比 =
- 图形上表示结果和完整的统计分析, 使用 t 检验或方差分析, 根据被比较的组数。
Representative Results
图 3提供了使用该协议的雄性和雌性成年 c57bl 6 小鼠获得的典型阳性和阴性结果的例子6。olt 和 nort 数据的解释始终适用于组的聚合数据 (请参阅下面的讨论)。单个鼠标的调查时间不能解释为内存或内存不足。然而, 一组老鼠 (即多个样本) 的表现可以与其他组相比较, 也可以与使用统计测试的固定机会水平进行比较。在一个典型的训练试验中, 一组老鼠平均对这两个物体都没有明显的偏好, 因为它们都同样新颖, 对小鼠没有任何内在的负值或正值 (图 3 a和3 b)。如果一组老鼠的汇总数据在训练过程中显示出对一个对象的显著偏好, 则不应使用这些对象, 因为固有的偏好/厌恶会混淆随后的试验结果。此外, 所有小鼠的总调查时间必须达到最低标准 (传统上定为 20秒21), 并应进行比较, 以确保调查没有基线差异, 可能会影响随后的记忆测试。
在 olt 期间, 对象位置的内存反映在老鼠平均花费了超过移动对象总调查时间50% 以上的情况 (图 3 a)。如果单个小鼠的总调查时间相差很大, 结果最好描述为对象的判别指数 (图 3b)。图3b 中平均判别指数的显著增加表明, 小鼠在物体移动后花了更多的时间与物体在一起。无论是以百分比时间的增加还是以歧视指数来衡量, 物体移动后的调查量的增加都表明, 老鼠在训练中记住了物体的位置。
该协议的最后一次试验评估了目标识别内存。一组小鼠的一个代表性例子显示, 与50% 和0的固定控制值相比, 调查时间的平均百分比 (图 3c) 以及正区别指数 (图 3C) 分别较高。与 olt 数据一样, 如果单个小鼠之间的总调查时间有显著变化, 那么判别指数可能是可视化这些数据的更好方法。图 3e显示了 nort 中2组比较的一个示例, 以及在这些测试中可能出现的一些统计复杂性 (见讨论)。虽然 b 组的单样本 t 测试显示调查明显高于 50%, 但 a 组的同一测试则没有。这一发现并不意味着 a 和 b 是不同的。要确定组差异, 必须执行单独的两个样本非参数曼恩-惠特尼比较组 b 到 a。对这一代表性群体数据进行的双样本非参数曼-惠特尼测试显示, 两组在新对象调查时间百分比方面没有显著差异 (p = 0.66)。
olt 和 nort 都对对象的内在价值高度敏感, 必须对对象等效性进行彻底测试, 以确保没有可能混淆结果的内在偏差。图 3f和3F显示了一个不适当的对象选择示例。在样本大小为4的试点测试中, 小鼠在与对象 b 配对时, 显示出与对象 a 配对时, 与对象 a 的调查时间不到50% 的趋势 (图 3f)。当这些对象在 nort 中使用, 对象 a 为新对象, 样本大小较大的 16个, 小鼠使用对象 a (图 3g) 花费的时间明显少于50%。这种对小说对象的厌恶在这里很容易被识别为实验中的一个技术缺陷, 并说明了为什么对对象进行固有的偏好/厌恶的试点测试是必不可少的。
图 3: 野生型成人 c57bl6 小鼠的行为测试数据.(a) 在训练试验期间, 移动对象的总调查时间与 olt 的比较显示, 在移动对象后, 调查量显著增加。p & lt; 0.0001, 配对 t 检验。(b) 在培训期间对移动物体进行调查的代表性结果和作为歧视指数显示的 olt 试验结果同样表明, 在移动物体后, 对其的调查显著增加。p & lt; 0.0001, 配对 t 检验。(c) nort 中新对象的总调查时间百分比明显倾向于研究新对象。* * p = 0.0024, 单样品 t-测试与50%。(d) 作为判别指数显示的 nort 新对象调查的代表性结果同样显示出对研究新对象的偏好。* * p = 0.0024, 单样本 t 检验与0。(e) 涉及两组不同小鼠的 nort 分析的代表性结果。b 组与单样品 t 测试的50% 有很大不同 (* * p = 0.0024), 但 a 组没有 (p = 0.0024)。在另一项分析中, 为了比较组, 使用了两样本 mann-whitney 测试, 因为组大小不均匀, 在调查中没有发现显著差异 (p = 0.66, ns)。(f) 在小样本大小的验证试验中, 与对象在一起的时间百分比显示出对该对象的厌恶趋势。p = 0.2 159, 单样品 t 测试。(g) 由于在 nort 中使用了较大的样本大小和来自 (f) 的物体作为新对象, 即使它是新对象, 也会发现对该物体的强烈反感。* p = 0.0270, 单样品 t 测试。这是对象选择中技术失败的一个示例。数据以平均± sem 的形式显示, c-e 面板的数据改编自以前的出版物6。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
该协议为小鼠进行目标定位和新的目标识别行为测试提供了一种经济高效的方法。这些测试能够评估海马功能以及其他皮质区域的功能, 如前额叶皮层, 参与对象识别10。olt 和 nort 的优点是避免刺激与强烈的情感价值所需的莫里斯水迷宫, 上下文恐惧条件, 巴恩斯迷宫或径向手臂迷宫。他们还避免了放射状手臂迷宫所需的食物剥夺。此外, 该协议描述了一个简单的两天测试程序, 不需要大量或复杂的设备来执行或分析。这些任务的一个缺点是不允许采取学习或获取措施。新颖性调查的一个区别可能是由于在训练中对物体的了解较差, 对所学知识的记忆较差, 或者两者兼而有之。调查对象所花费的总时间是排除勘探活动中任何固有差异的重要措施, 但不是衡量学习的标准。如果学习的措施对实验问题很重要, 那么水迷宫、巴恩斯迷宫或径向手臂迷宫可能更可取。
行为竞技场的定制建设有可能节省数百美元, 并将对象测试纳入各种实验室的财务范围。该协议消除了许多障碍, 简化了制造过程, 使没有丙烯酸专业培训的科学家更容易获得内部竞技场建设。需要注意的是, 购买与小鼠形成对比的彩色丙烯酸片, 如黑鼠用的白色丙烯酸和白鼠的黑色丙烯酸, 将有助于数据采集和分析, 特别是在使用市售产品时分析软件。订购带有 "布线边缘" 的切尺寸板材无需表锯 (表 1), 使用丙烯酸水泥无需钻孔和反沉导孔。在紧固件、钻孔和切割丙烯酸时, 由于其脆性的性质, 经常会导致其断裂、碎屑和裂纹。因为水泥是一种溶剂, 它将流入被连接的区域, 溶解和软化它遇到的任何丙烯酸。因此, 它不应该单独适用于每一块, 就好像它是一个传统的胶水。与胶水不同的是, 水泥不会填充负空格或粘附在表面上。这是订购 "路由边缘" 的主要原因, 因为这将确保平滑和平坦的边缘, 创建更好的粘结。当水泥干涸时, 它将把两片丙烯酸片融合成一块, 这个过程被称为 "溶剂焊接"。就像金属焊接一样, 成品是单件, 但焊接面积永远是最薄弱的位置。因此, 一旦竞技场使用, 应注意避免在这些路口受到直接影响或极端压力。
该协议还演示了如何设置4个竞技场, 以便同时测试多达4只小鼠 (图 1和图 2)。竞技场的不透明墙壁使老鼠在测试过程中无法互相看到, 但仍有可能在房间里有其他老鼠会导致气味或噪音干扰, 从而损害测试。这里详细介绍的栖息试验可以帮助缓解这种担忧, 因为老鼠在行为测试之前接触到多动物室的条件。然而, 如果干扰其他老鼠或实验者的噪音与处理其他老鼠是一个强烈的问题, 一个竞技场, 一个老鼠, 也可以使用, 虽然这将增加完成 olt 和 nort 与多个鼠标所需的时间。理论上还可以使用4个以上的竞技场, 但大多数摄像机的视野不够宽, 无法显示许多竞技场的分辨率很好。
此处提供的尺寸和距离是在典型的测试室中进行鼠标行为测试的一般准则, 该测试室的尺寸为 16 x 16 x 16 米 3 (图 1 b和1B)。必须针对每个环境优化设置适当的环境提示、竞技场和视频录制设备。色调可以由大的形状或图案 (通常为黑色和白色) 组成, 使小鼠能够在 olt 期间对自己进行空间定位。线索也可以安装在测试区域的墙壁上, 而不是在彼此不同的不同位置放置线索。该协议建议在行为测试期间用窗帘将试验室分开, 以隐藏研究人员和计算机。在所有的习惯、试验间隔和积极的试验中, 研究人员应该关闭窗帘, 将自己与试验区分开。如果这不实际, 计算机可以保留在老鼠的视野中, 但研究人员在任务期间必须移出视线。如果研究人员在场, 老鼠可能会试图依靠她或他作为空间暗示。
所有的行为测试都应该在温度和湿度控制的环境中完成, 温度和湿度控制的环境应该暗淡, 但即使是在 310个 lux 和最小的外来声音或强烈的环境气味提示, 如实验者的香水照明。在每个试验和测试日之间, 所有的竞技场和物体都应该用动物设施推荐的消毒方法进行清洗, 比如用70% 的乙醇或无香味的漂白剂擦拭, 以最大限度地减少嗅觉暗示。如果使用化学消毒剂, 建议使用70% 乙醇进行最后的冲洗, 因为许多化学消毒剂会刺激动物的脚。 与任何行为任务一样, 在测试前对鼠标进行几天的处理是必要的, 以便让它们熟悉将执行 olt 和 nort 的个体, 并在测试20、22 期间减轻压力。由于小鼠在试验区附近可能会因为不熟悉的个体而经历急性压力, 因此也建议所有行为测试都应由同一个体完成。该协议中详细列出的测试参数和条件已针对6至9只年龄的成年 c57bl6 小鼠进行了优化, 对于揭示这一年龄组的损伤或年龄较大的小鼠的记忆损伤 (导致年龄本身) 最为有用。如果目的是测试幼鼠记忆力的改善, 延长 iti 时间从1小时到1天不等, 以避免对更简单的 20分钟 iti 版本的性能产生上限影响。事实上, i t i 可以从 5分钟 (立即召回) 到几个小时或几天 (遥远的记忆) 不等, 这取决于实验的具体需要以及老鼠的毒株和年龄。重要的是, 无论长度长短, 实验中的所有 iti 都应在会话之间保持一致。由于不同的菌株和年龄的小鼠表现出不同的行为和学习, 每个试验和间隔的时间, 测试区域的安排, 和使用的对象可以根据小鼠的特殊菌株, 他们的年龄, 和特定的损伤/疾病干预模型正在测试 9,21,23,25。
虽然在 olt 中测试的空间记忆功能的海马依赖性已经建立, 但 nort 可能依赖也可能不依赖海马体。对 nort 数据的解释应考虑到这一点。确定变量, 对于海马是否涉及, 在对象识别记忆中还没有达成一致, 但可能包括 iti 长度或空间线索18的显著性。值得注意的是, 所提出的协议在 nort 之前使用了空间 olt, 这可能会使小鼠倾向于在 nort 中使用海马过程。因此, 需要注意的是, 顺序可以反转, 或者每个任务都可以独立运行, 这取决于实验者的问题和需求。
对象选择是 olt 和 nort22、24 的一个重要方面。理想的物体足够重, 不容易被老鼠取代, 用玻璃或金属等材料制成, 老鼠不能因为咀嚼或抓伤而损坏。木制、泡沫或软塑料物体不合适, 因为它们很容易变形, 难以保持无异味。此外, 试验中使用的物体在大小、质地、气味和材料方面都应相对相似。图 1d给出了一个可以使用的适当对象的示例。小鸡的橙色塑料雕像充满了沙子, 使其具有足够的重量和密封, 以防止泄漏的清洁剂或其他造成异味的试剂。由于顶部的形状, 老鼠无法爬上这个物体的顶部或坐在这个物体上。对于 olt 或 nort, 此对象最好与另一个大小、重量、材料、颜色和复杂性的对象配对, 例如兔子的类似塑料雕像。为确保对象调查真正反映了对新颖性的偏好, 所有对象都必须验证为等效的内在值, 至少有8只小鼠处于与协议第2.9 节所述相同的菌株、性别和实验组年龄。此外, 对象应随机选择在同一研究中, 哪个对象是新的对象或在小鼠之间移动的对象, 以进一步确保对象的固有特性不会影响偏好。对象放置也会极大地影响 olt 和 nort 的成功或失败。物体必须在竞技场上进行平衡, 不要离墙壁太近。一个被物体拥挤的角落是老鼠躲起来的一个吸引人的地方, 这将混淆调查措施。
数据收集的一个重要先决条件是定义 "主动调查", 即鼠标将一个物体与鼻子指向不超过2厘米远的物体。鼠标在对象顶部移动或从对象过去看不符合活动调查的条件。此外, 由于 olt 和 nort 依赖于鼠标记住对象的空间位置或实际特征, 因此在训练试验中必须对这些特征进行充分的研究。因此, 研究人员必须确定最低调查时间, 并排除任何不符合传统调查基线水平的研究对象, 传统上定为20秒 21.
对象调查时间的量化可以通过各种方式完成, 无论是否有昂贵的分析软件。如果使用手动评分 (如这里所述), 则可以通过在鼠标调查对象时将时间戳记录在视频上实现最全面的数据收集。在三个单独的试验中记录对象调查的开始和停止时间, 可以创建一个永久的无偏时间戳日志, 并有助于准确手动计算数据, 而不是使用秒表等替代方法。额外记录鼠标调查每个对象的总时间。
商业软件包也可用于评分对象调查。商业上可用的软件可以提供丰富的数据, 超出这里描述的手得分数据, 包括总行驶距离, 花费在竞技场某些区域的时间量, 以及移动速度 16,23。软件一旦经过适当校准和确认, 以可靠地检测到物体的调查, 也可以产生比手动评分快得多的数据。从长远来看, 与人工评分所需的工时相比, 这种更快的数据产生率可能会产生净节约。然而, 大多数用于行为分析的软件包都有很高的前期成本, 这对许多实验室来说可能是令人望而却步的, 而人工评分通常可以由学生研究人员完成, 从而使行为评分的每小时成本降至最低。商业软件还经常限制有多少用户可以同时访问该软件, 从而限制了数据吞吐量和节省时间。虽然这些软件包有许多优点, 但它们不需要从 olt 和 nort 收集时间调查对象的基本信息。手动获取这些数据的能力使更多的研究人员在财务上更容易获得新的对象任务。
该协议的另一个特点是, 第一次习惯会议本质上是在开放领域的试验, 它可以产生关于活动和焦虑程度的数据。如果跟踪软件可用, 则可以使用总行驶距离或平均速度来量化活动级别。同样, 有了跟踪软件, 焦虑措施也可以从在竞技场中心度过的时间或在中心行驶的距离中得出。这些数据也可以通过用网格覆盖竞技场视频和量化交叉来手动获取。这种开放的现场数据可以帮助排除汽车总赤字或过度焦虑, 这可能会干扰以后的对象调查。
该协议中使用的统计测试代表了传统的分析方法。在比较两组小鼠时, 建议进行双样本、双尾 t 检验, 以测试两组之间调查移动对象或新物体的百分比差异的意义。如果样本量不均匀、具有极高的可变性或显示组之间的不均匀变异性, 则建议进行非参数测试, 因为在这些条件下将违反 t-test 的许多基本假设。在比较3组或更多的小鼠时, 建议方差分析测试组对调查移动或新物体的百分比是否有显著影响。然后, 可以应用错误修正后的测试 (如 tukey 的测试或 bonferroni 校正的对比较) 来测试每对组之间调查时间的百分比差异。使用 olt, 分析数据的另一种方法是测试从训练到 olt 试验的调查移动对象的百分比变化百分比。对于只有一组老鼠, 此测试将采取配对双尾 t 测试的形式, 测试移动对象从训练到 olt 在每个鼠标中的百分比时间的显著变化 (请记住, 这些都是配对分析, 而不是独立的测量, 因为每个鼠标产生两个数据点)。对于两组小鼠, 将采用双向方差分析的重复措施, 重复的措施是试验 (训练与 olt) 和小组分配是第二个因素。治疗组之间差异的事后测试应在试验中对治疗组进行比较。
或者, 如果正在测试的所有 olt 或 nort 中的内存证据, 则可以使用一个样本 t 测试, 测试调查对象的时间百分比与50% 的固定值。显著高于50% 的时间表明对象的内存。明显低于50% 的时间表明厌恶 (出于某些原因), 对象的选择应该重新评估。然而, 单样本 t 检验无法揭示两个或两个以上的群体之间是否存在差异。例如, 在对两组小鼠进行的实验中, 如果 a 组将60% 的时间用于 p = 0.049 的新对象, 则单样本 t 测试与50% 的时间相比较较, 而 b 组仅将59% 的时间用于 p = 0.049 的新对象, a 组与50% 有显著差异 (b 组则不然)。然而, 关于这两个群体之间存在显著差异的结论是错误的。比较 a 和 b 的两个样本 t 检验可以很容易地发现, 这两组在统计上是无法区分的。如果最终目标是比较两个或两个以上组的内存性能, 则必须对这些组进行统计比较, 而不仅仅是与外部标准进行比较。类似的准则适用于在训练和 olt 之间比较使用移动对象所花费的时间。在这种情况下, 在一个组中发现移动对象与 olt 之间在百分比时间上的显著差异并不表明这些组在统计上是不同的。在每个审判中, 小组必须是事后比较的, 而不仅仅是在小组内的审判之间。
重要的是要记住, 任何单个鼠标的调查时间都不能作为记忆的证据或不利于记忆的证据。相反, 这些任务中对象位置或标识的内存只能根据与另一组的聚合数据或固定机会级别进行统计比较的聚合数据来完成 (时间为 50%, 区分比率为 0)。所需的样本大小将在很大程度上取决于特定操作的效果大小和行为的可变性, 而这两者又将取决于所使用的老鼠。年龄、性别和操纵都会影响变异性。在图 3 a 和3 b中提供的示例数据中, n = 14名受试者使用了, 对于α = 0.05 的配对 t 检验, 其效果大小为 0.68, 功率为0.68。如果此比较需要0.8 的功率, 则需要18的采样大小。
这种讨论是围绕 p 值和意义截止点进行的, 因为这些是 olt 和 nort 数据最常见的度量值和分析, 因此可能为实验者和评审者所熟悉。这种对 p 值的依赖被严厉批评为统计上无效26。然而, 尽管替代分析方法存在, 并在一些期刊27中得到认可, 但行为和生物医学领域并没有广泛采用替代分析方法作为标准26。
总之, 该协议以最低的成本有效地测试小鼠的内存。其中包括对议定书进行适当修改的建议, 以确保任何小鼠模型的成功实施。该方案应用于特定的损伤或治疗干预模型可以揭示有价值的功能相关性, 补充正在研究的细胞和分子机制。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由 nih 的 r00 ns08999938 和俄亥俄州立大学长期脑损伤和发现主题的种子资助资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 15.75" x 15.75" with Routed Edges |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 15.75" x 16.5" with Routed Edges |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 16.5" x 16.5" with Routed Edges |
| TAP Acryllic Cement (1 pt.) | TAP Plastics | NA | |
| 16 G Hypo Applicator | TAP Plastics | NA | |
| Debut Video Capture Software Pro Edition | NCH Software | NA | |
| Stanely SAE/Metric Comb Square | Grainger | 6R171 | |
| Logitech Pro Stream Webcam C922x | CDW | 4429927 | |
| Belkin 16' USB 2.0 Active Extension Cable | CDW | 570691 | |
| Panduit Pan-Way LD Surface Raceway (8') | CDW | 300902 | |
| Spatial/Environmental Cues | Variable | NA | |
| Objects for testing | Variable | NA | |
| 70% ethanol | Variable | NA | |
| Double-sided tape | Variable | NA |
References
- Krakauer, J. W., Ghazanfar, A. A., Gomez-Marin, A., Maclver, M. A., Poeppel, D. Neuroscience Needs Behavior: Correcting a Reductionist Bias. Neuron. 93 (3), 480-490 (2017).
- Lange, F., Seer, C., Kopp, B. Cognitive flexibility in neurological disorders: Cognitive components and event-related potentials. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 83, 496-507 (2017).
- Barnett, J. H., Blackwell, A. D., Sahakian, B. J., Robbins, T. W. The Paired Associates Learning (PAL) Test: 30 Years of CANTAB Translational Neuroscience from Laboratory to Bedside in Dementia Research. Current Topics in Behavioral Neuroscience. 28, 449-474 (2016).
- Eichenbaum, H., Otto, T., Cohen, N. J. The hippocampus-what does it do? Behavioral and Neural Biology. 57 (1), 2-36 (1992).
- Bartsch, T., Wulff, P. The hippocampus in aging and disease: From plasticity to vulnerability. Neuroscience. 19 (309), 1-16 (2015).
- Smith, B. M., Yao, X., Chen, K. S., Kirby, E. D. A Larger Social Network Enhances Novel Object Location Memory and Reduces Hippocampal Microgliosis in Aged Mice. Frontiers in Aging Neuroscience. 10 (142), 1-16 (2018).
- Chieffi, S., et al. Exercise Influence on Hippocampal Function: Possible Involvement of Orexin-A. Frontiers in Physiology. 14 (8), 85 (2017).
- Garth, A., Roeder, I., Kempermann, G. Mice in an enriched environment learn more flexibly because of adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 26 (2), 261-271 (2016).
- Brown, R. E., Stanford, L., Schellinck, H. M. Developing standardized behavioral tests for knockout and mutant mice. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (3), 163-174 (2000).
- Barker, G. R., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory? Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).
- Savage, S., Ma, D.
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures? Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. Examining object location and object recognition memory in mice. Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).
- Ammassari-Teule, M., Passino, E. The dorsal hippocampus is selectively involved in the processing of spatial information even in mice with a genetic hippocampal dysfunction. Psychobiology. 25 (2), 118-125 (1997).
- Le Merrer, J., Rezai, X., Scherrer, G., Becker, J. A., Kieffer, B. L. Impaired hippocampus-dependent and facilitated striatum-dependent behaviors in mice lacking the delta opioid receptor. Neuropsychopharmacology. 38 (6), 1050-1059 (2013).
- Hattiangady, B., et al. Object location and object recognition memory impairments, motivation deficits and depression in a model of Gulf War illness. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 78 (2014).
- Oliveira, A. M., Hawk, J. D., Abel, T., Havekes, R. Post-training reversible inactivation of the hippocampus enhances novel object recognition memory. Learning and Memory. 17 (3), 155-160 (2010).
- Cohen, S. J., Stackman, R. W. Jr Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. Behavioral Brain Research. 285, 105-117 (2014).
- Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioral Brain Research. 31 (1), 47-49 (1988).
- Leger, M., et al.
- Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. Public Library of Science ONE. 11 (1), e0147733 (2016).
- Ennaceur, A. One-trial object recognition in rats and mice: methodological and theoretical issues. Behavioural Brain Research. 215, 244-254 (2010).
- Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718 (2017).
- Wasserstein, R. L., Lazar, N. A. The ASA's Statement on p-Values: Context, Process, and Purpose. The American Statistician. 70 (2), 129-133 (2016).
- Ranstam, J. Why the P-value culture is bad and confidence intervals a better alternative. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (8), 805-808 (2012).
