Farelerde uyku/uyanıklık durumları Izleme sırasında nöral devrelerin optogenetik manipülasyon
Summary
Burada, biz farelerde uyku/uyanıklık devletlerin izlenmesi sırasında nöronların belirli türlerinin optogenetik manipülasyon yöntemlerini açıklamak, bir örnek olarak stria terminalis yatak çekirdeği üzerinde son çalışma sunma.
Abstract
Son yıllarda, optogenetik yaygın nörooscientifik araştırma birçok alanda kullanılmıştır. Birçok durumda, bir opsin, kanal rodopsin 2 (ChR2) gibi, çeşitli CRE-sürücü fareler nöronal hücrelerin belirli bir tür bir virüs vektörü tarafından ifade edilir. Bu opgünahların aktivasyonu, lazer veya LED optik kablolar aracılığıyla teslim edilen ışık darbeleri uygulaması ile tetiklenir ve aktivasyon etkisi çok yüksek zaman çözünürlüğü ile görülür. Deneyler, farelerde davranışı veya başka bir fizyolojik sonucu izlerken nöronları akut uyarmak edebiliyoruz. Optogenetiği, farelerde uyku/uyanıklık devletlerinin düzenlenmesi nöronal devrelerin fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı stratejiler olanaklı kılmak. Burada, farelerin uyku aşamasını değerlendirmek için elektroensefalogram (EEG) ve elektromiyogram (EMG) izleme sırasında belirli bir kimyasal kimliğe sahip olan nöronların optogenetik manipülasyonunun etkisini incelemek için bir teknik açıklanmaktadır. Örneğin, biz stria terminalis (BNST) yatak çekirdeğinde GABAerjik nöronların manipülasyon açıklanmaktadır. Bu nöronların akut optogenetik uyarılması NREM uyku sırasında uygulandığında uyanıklık hızlı bir geçiş tetikler. EEG/EMG kayıt ile birlikte optogenetik manipülasyon uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen nöronal devreler deşifre için uygulanabilir.
Introduction
Optimum bilişsel fonksiyon için uyku önemlidir. Son bulgular da uyku bozuklukları çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir1,2,3. Uyku fonksiyonları henüz büyük ölçüde çözülmemiş olmasına rağmen, son zamanlarda sinir devreleri ve uyku/uyanıklık Devletler4kontrol mekanizmaları anlamada önemli ilerleme yapılmıştır. Memelilerde, uyanık üç devlet vardır: uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi (NREM) uyku, ve hızlı göz hareketi (REM) uyku. Uyanıklık, hızlı EEG osilasyonlarıyla (5-12 Hz), maksatlı ve sürekli motor aktivitesi ile düşük amplitüd ile karakterize edilir. NREM uyku (1-4 Hz) yüksek amplitüd (Delta dalgaları), bilinç eksikliği ve amaç motor aktivitesi ile yavaş salınımlar tarafından tanımlanır. REM uykusu nispeten hızlı salınımlar (6-12 Hz) düşük amplitüd ve neredeyse komple bilateral kas atonia5ile karakterize edilir.
Borbely, iki proses modeli6,7olarak bilinen uyku-uyanıklık Yönetmeliği teorisi önerdi. Bir homeostatik süreç, aynı zamanda işlem S olarak adlandırılır, uyanıklık sırasında birikir ve uyku sırasında dağılıyor uyku basıncını temsil eder. C süreci olarak adlandırılan bir başka süreç ise, 24 saat döngüsünde neden uyanık düzeylerinin dalgalanacağını açıklayan bir sirkadiyen süreçtir. Bu iki süreçlere ek olarak, allostatik faktörler uyku/uyanıklık8,9düzenlenmesi için de önemlidir. Allostatic faktörler beslenme durumları ve duygu içerir. Korku ve anksiyete genellikle otozik ve nöroendokrin tepkiler ile birlikte uyarılma artışı eşlik eder10,11,12. Limbik sistem korku ve anksiyete düzenlenmesi bir rol oynamaya inanılır, ve otonjik ve nöroendokrin tepkiler altta yatan mekanizmalar kapsamlı olarak incelenmiştir, ancak limbik sistem uyku/uyanıklık durumları etkileyen yol değil henüz ortaya çıktı. Opto-ve Farmakogenetik kullanan son çalışmalar çok sayıda nöronlar ve uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen nöronal devrelerin beyin boyunca dağıtılır önerdi, korsinler dahil, bazal forebrain, talamus, hipotalamus, ve beyin kökü. Özellikle, optogenetik son gelişmeler bize uyarmak veya belirli nöral devreler in vivo yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde inhibe izin verdik. Bu teknik uyku ve uyanıklık nöral substratlar bizim anlayışımızda ilerleme sağlayacak, ve nasıl uyku/uyanıklık Devletler sirkadiyen süreçleri tarafından düzenlenir, uyku basıncı, ve allostatik faktörler, duygu dahil. Bu yazıda, NREM uyku, REM uyku düzenlenmesi bir rol oynayan beyinde konektoumunu ve mekanizmalar bizim anlayışımızı güncellemek için potansiyeli olabilir uyku/uyandırma kaydı ile birlikte optogenetik manipülasyon nasıl kullanılacağı tanıtmak amaçlamaktadır, ve uyanıklık. Hangi limbik sistem uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen bu mekanizmanın anlayış sağlık için önemli bir önem taşımaktadır, çünkü uykusuzluk genellikle anksiyete ya da uyku mümkün olma korkusu ile ilişkilidir (somniphobia).
BNST anksiyete ve korku önemli bir rol oynamak için düşünülmektedir. Gad 67-gabaergic nöronlar ifade bnst12,13büyük bir nüfus vardır. Biz bu nöronların optogenetik manipülasyon etkisini inceledi (GABABnst) uyku/uyanıklık Devletler. Son yıllarda Nörobilim en büyük gelişmelerden biri, yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde ile, özel kimyasal kimlikleri in vivo ile nöronların manipülasyon sağlayan yöntemler olmuştur. Optogenetiği nöral aktivite ve spesifik davranışsal tepkiler14arasındaki nedensel bağlantıları göstermek için son derece yararlıdır. Biz uyku/uyanıklık devletlerin düzenlenmesi tanımlanan nöral devrelerin işlevsel bağlantı incelemek için bir yöntem olarak optogenetik tarif. Bu tekniği kullanarak, uyku/uyanıklık durumları düzenleyen nöronal devreleri anlamak için büyük bir ilerleme elde edilmiştir15,16,17,18,19 . Birçok durumda, opsins özellikle CRE-sürücü fareler ve CRE-indüklenebilir AAV aracılı gen transfer kombinasyonu ile seçici beyin bölgelerinde belirli kimyasal kimlikleri ile nöronlar tanıtıldı. Ayrıca, bir CRE-loxP veya FLP-FRT sistemi ile birlikte channelrhodopsin 2 (ChR2)20 veya archaerhodopsin (archt)21 gibi fotoğraf duyarlı opgünahların fokal ifade bize seçici bir nöronal nüfus ve spesifik manipüle sağlar nöral yol22.
Biz burada bir örnek olarak BNST içinde GABAergic nöronlar üzerinde deneyler tarif. Belirlenmiş bir nöronal nüfus opsins ifade etmek için, uygun CRE sürücü fareler ve CRE bağımlı virüs vektörler en sık kullanılır. Opgünahların özellikle nöronal nüfus içinde ifade edildiği transgenik veya Knock-in hatları da yararlıdır. Aşağıdaki deneyler, biz kullanılan GAD67-CRE Knock-in fareler23 hangi sadece gabaergic nöronlar bir C57BL/6J genetik arka plan ile CRE Rekombinaz Ifade, ve bir AAV vektörü IÇEREN ChR2 (hChR2 H134R) BIR kontrol olarak EYFP veya EYFP ile kaynama “FLEx (Flip-eksizyon) anahtarı” ile24. Prosedür özellikle uyku/uyanıklık Devletler25izlenmesi sırasında bnst Içinde gabaeroid nöronların optogenetiği uyarılma açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz burada uyku/uyanıklık devlet geçişleri üzerinde belirli kimyasal kimlikleri ile nöronların optogenetik stimülasyon etkisini değerlendirmek için bir yöntem sundu ve GABABnst nöronların manipülasyon bir örnek verdi. Bizim veri gösterdi GABAbnst nöronlar optogenetic uyarılma wakefulness NREM uyku hemen geçiş sonuçları.
Çeşitli Deneysel tasarımlar, birçok türde optogenetik araç gelişimi nedeniyle mevcuttur. Etkinleştirmek ya da ChR2, SSFO, ha…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada, Merck araştırmacı çalışmalar programı (#54843), bir KAKENHI Grant-in-yardım yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için, “WillDynamics” (16H06401) (T.S.) ve bir KAKENHI Grant-in-yardım yenilikçi alanlar (T.S.) üzerinde keşif araştırması için destek oldu (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
Referencias
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?. Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. . Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
