Пищеварение мышиных печени для анализа гранулярных поток лимфы эндотелиальных клеток
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в идентификации населения лимфатический эндотелиальных клеток в печени с помощью описанных маркеров. Мы используем коллагеназы IV и DNase и нежный мясорубки ткани, в сочетании с проточной цитометрии, чтобы определить собственный населения лимфатический эндотелиальных клеток.
Abstract
В печени лимфатические сосуды находятся в пределах портала триады, и их описывается функция удаление интерстициальной жидкости из печени в лимфатические узлы где можно обследованных сотовой мусора и антигены. Мы очень заинтересованы в понимании, как лимфатический сосудистую могут быть вовлечены в воспаление и функция иммунных клеток в печени. Однако, очень мало был опубликован создание пищеварение протоколов для изоляция лимфатическую эндотелиальных клеток (LECs) из печени или определенных маркеров, которые могут быть использованы для оценки функции печени МГС на основе за клеток. Таким образом мы оптимизированный метод для пищеварения и окрашивание печени с целью оценить LEC населения в печени. Мы убеждены в том, что метод конспектированный здесь будет полезным для выявления и изоляции LECs из печени и укрепит наше понимание как LECs реагировать печень микроокружения.
Introduction
Не хорошо понимают роль лимфатические сосуды и МГС в печени. В то время как лимфатические сосуды находятся в пределах портала Триада печени1 и расширять во время болезни2, очень мало понимается относительно функции и фенотип МГС в печени. С открытием маркеров, которые находятся главным образом на МГС3важность этих клеток в различных тканей ниши в гомеостаза и болезни будет заполнить значительный пробел в нашем понимании. МГС играют важную роль в поддержании периферийных терпимости в лимфатических узлов и метастатические опухоли, взаимодействуя непосредственно с T клетки4,5,6,,78, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. МГС в лимфатических узлов может способствовать защитный иммунитет через их взаимодействие с мигрирующие дендритные клетки14,,1516. Таким образом существует несколько ролей для LECs, которые могут быть специфическими для тканей и взаимодействия, в которых они присутствуют. Однако очень мало понимается как LECs взаимодействуют с иммунных клеток в тканях или как LECs функционируют в различных органов и систем; Таким образом оценки МГС на основе за клеток в печени или других органов может привести к достижения в LECs, как программы ткани конкретных иммунитета. Хотя большая часть литературы, которая сосредотачивается на МГС в печени использует микроскопии для визуализации LECs, используя один или два маркеры и морфология17, очень мало было сделано для конкретно оценить МГС на основе по ячейкам с помощью проточной цитометрии, хотя одно исследование оценить различия между синусоидального эндотелиальных клеток печени (LSECs) и МГС18. Возможность анализировать LEC населения в печени подачей cytometry позволяет для углубленного изучения LEC фенотип во время нормальной гомеостаза или болезни.
Чтобы оценить LECs подачей cytometry, необходимы несколько поверхностных маркеров. Как правило LECs визуализируются выражение связанных с Просперо гомеобокс 1 (Prox-1), лимфатический сосуд эндотелиальной гиалуроновая кислота рецепторов 1 (LYVE1) или Сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептор 3 (VEGFR3) с помощью микроскопии. Однако в печени, выражение этих маркеров не ограничивается МГС. Prox-1 широко выражается гепатоцитов во время регенерации печени развития и травмы19, и LYVE1 и VEGFR3 являются выраженные эндотелиальных клеток печени синусоидального18. В лимфоузел, LECs идентифицируются с помощью проточной цитометрии как кластеры дифференциации (CD) CD45 – CD31 + и podoplanin + (PDPN)16. Однако этот подход является слишком минимальной, чтобы изолировать МГС в печени, так как CD45 – CD31 + клетки будет захватить эндотелиальных клеток, а преобладающее население сосудистой эндотелиальных клеток в печени LSECs. Таким образом другие маркеры необходимо различать редких LEC населения с обильным LSEC населения. CD16/32 (выраженные Зрелые LSECs18) и CD146 (общий сосудистый эндотелиальных клеток маркер, преимущественно, выраженные в печени синусоиды20 синусоидального эндотелиальных клеток печени с практически не выражение лимфатической эндотелиальные клетки21) были кандидат маркеров.
Таким образом мы оптимизированный метод для изоляции и визуализации МГС в печени, используя выше маркеров, CD45, CD31, CD146, CD16/32 и PDPN для проточной цитометрии. Мы описывают использование коллагеназы IV, DNase 1 и механического разделения для переваривания ткани печени в одну ячейку подвеска. Мы также описывают использование градиента плотности iodixanol для изоляции не Паренхиматозный клеток (NPC) и ликвидации сотовой мусора. Наконец мы с использованием нескольких маркеров, определить оптимальный поток цитометрии стробирования стратегию для выявления LECs из печени с PDPN как основной маркер.
Protocol
Representative Results
Discussion
Общее значение МГС в иммунного гомеостаза и регулирование недавно пришло света25. Большая часть опубликованных лимфатический литературы фокусируется на кожу и лимфатические узлы; Однако лимфатические находятся во всем теле26 и, таким образом, необходимо наше ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить GI и печени Innate иммунных программы за финансовую поддержку этого проекта. B.A.J.T. также финансируется R01 AI121209.
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
Referencias
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver–re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from “oval cells”. Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).
