تدفق سيتوميتريك الكشف عن خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي التي شكلت حديثا بعد عكس المبرمج
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لعزل apoptotic خلايا سرطان الثدي عن طريق فرز fluorescence تنشيط الخلية وكذلك الكشف عن انتقال خلايا جذعية غير سرطان الثدي إلى خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي بعد عكس المبرمج بالتدفق الخلوي.
Abstract
منذ فترة طويلة درس تكرار سرطان بالأورام في حين الآليات الأساسية التي لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة، نحن وآخرون تبين أن ظاهرة يدعى عكس المبرمج يؤدي إلى زيادة توموريجينيسيتي في مختلف النماذج الخلية تحت المحفزات المختلفة. وقد تركزت الدراسات السابقة في تتبع هذه العملية في المختبر والحية؛ ومع ذلك، عزل خلايا حقيقية عكس لم يتحقق، الذي يحد من فهمنا في النتائج المترتبة على عكس المبرمج. هنا، لنا أن نستفيد صبغة “كشف الأخضر” Caspase-3/7 لتسمية الخلايا مع caspases تنشيط بعد التعريفي أبوبتوتيك. كذلك يتم فرز الخلايا التي تحتوي على إشارات إيجابية بها fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لاسترداد. دراسة الخصائص المورفولوجية تحت المجهر [كنفوكل] يساعد على تأكيد حالة apoptotic قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. زيادة في توموريجينيسيتي وكثيراً ما يمكن أن يعزى إلى ارتفاع النسبة المئوية للخلايا الجذعية السرطانية (CSC)-مثل الخلايا. أيضا، نظراً إلى التباين في سرطان الثدي، تحديد منشأ هذه الخلايا الشبيهة بديوان الخدمة المدنية ستكون حاسمة لعلاج السرطان. وهكذا، نحن نستعد الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي قبل تحريك المبرمج وعزل الخلايا caspase-تنشيط وتنفيذ إجراءات الإلغاء المبرمج. ويكشف تحليل التدفق الخلوي أن الثدي ديوان الخدمة المدنية-مثل الخلايا تظهر من جديد في المجموعة المعكوسة، مشيراً إلى ديوان الخدمة المدنية مثل خلايا الثدي هي عبور من الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي خلال عكس المبرمج. وباختصار، يشتمل هذا البروتوكول عزلة apoptotic خلايا سرطان الثدي والكشف عن التغيرات في النسبة المئوية لديوان الخدمة المدنية في الخلايا معكوسة بالتدفق الخلوي.
Introduction
وكان السرطان سبب الرئيسي للوفاة، مما تسبب عبئا ثقيلاً على البلدان في جميع أنحاء العالم1. سرطان الثدي برتب عالية سواء من حيث معدل الإصابة والوفيات في المرضى الإناث من بين جميع أنواع السرطان1. نظراً لعدم تجانس السرطان، يستخدم عادة مزيج من العقاقير في العلاج الكيميائي لتحقيق سرطان الخلية الموت2،،من34. بيد حيث كثيرا ما تستهدف المخدرات العلاج الكيميائي مشترك الحمض النووي5،6، البروتين التوليف7،8 و/أو microtubule الديناميات9، الخلايا التي تنمو بسرعة تتأثر أكثر من غيرها في حين خلايا هادئة مثل سرطان الخلايا الجذعية (CSC) s فهي عادة ما تكون أقل تأثرا10. وبالتالي، CSCs أكثر احتمالاً للبقاء على قيد الحياة بعد العلاج، مما يؤدي فيما بعد إلى مقاومة المخدرات والسرطان الانتكاس10،11. ومن ثم القضاء على CSCs أصبحت موضوعا هاما لعلاج السرطان ودراسة منشأ CSCs هو أمر ضروري.
مزيد من الدراسات حول ظاهرة عكس المبرمج قد أجريت في12،العقد الأخيرة13،15،14،16،،من1718 , 19-قبل ظهور هذا المفهوم، قد قبلت على نطاق واسع أن الخلايا سيخضع بلا رجعة المبرمج بعد تفعيل caspase. كاسباسيس هي عائلة من البروتين الإنزيمات التي تلعب أدواراً رئيسية في مراحل البدء والتنفيذ المبرمج، بما في ذلك تشكيل apoptotic معقدة، والانقسام ومن ركائز المصب20. يعتبر التنشيط من الجلاد caspases مثل caspase 3 أو caspase 7 “نقطة اللاعودة” للمبرمج21. ومع ذلك، لاحظ الباحثون مؤخرا أن يحدث عكس المبرمج على حد سواء في المختبر والمجراه في، خلال الخلايا التي يمكن استرداد من المبرمج حتى بعد تفعيل caspase12،،من1314 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19-وعلاوة على ذلك، سمات عدوانية مثل الكشف عن المقاومة أعلى الأصلي apoptotic محفز واختزاع أعلى في عكس السرطان الخلايا15. ومن ثم، اقترح أن النسبة المئوية للخلايا الشبيهة بديوان الخدمة المدنية ستكون أعلى في عكس السكان بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة، وتسهم في نهاية المطاف أكثر الخبيث ملامح بعد عكس المبرمج18.
سابقا، كثيرة بذلت جهود لتعقب المبرمج عكس في المختبر، والأهم من ذلك، الحية، مما يساعد كثيرا في تأكيد الطابع العالمي لهذه العملية16،،من1719. ومع ذلك، تفتقر إلى دراسة منهجية عن النتائج المترتبة على عكس الخلايا بسبب العزلة غير مرضية للخلايا التي مرت بصدق عكس المبرمج. وهناك حاجة للحصول على خلايا أبوبتوتيك نقية واستعادتها لمزيد من الدراسة. هكذا، نقوم باستخدام علامة المتعارف عليها جيدا لتفعيل caspase الجلاد كالعلامة من “نقطة اللاعودة”21 للمبرمج والاستفادة من الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تمييز الخلايا تفعيل caspase الملون مع صبغ “كشف الأخضر” Caspase-3/7. الصبغ تساهمي مرتبط بسلسلة قصيرة من الأحماض الأمينية، ديفد، التي يمكن الاعتراف بها والمشقوق من caspases النشطة 3/7. الانقسام ويساعد على إطلاق الصبغة، التي سوف ترانسلوكاتي من سيتوسول إلى نواة حيث يربط بالحمض النووي وتنبعث fluorescence قوية. ويتجنب هذا الإجراء استخدام سكان خلية الأكبر فيها بعض الخلايا قد لا خضعت [ابوبتوسس].
قد حددت CSCs أو الشروع في ورم الخلايا في الأورام الصلبة العديد من استخدام واحد أو مزيج من عدة marker(s) السطحية وعدد قليل جداً من هذه الخلايا كافية لشكل الأورام في الفئران العوز22،23، 24،25،،من2627. مزيج من CD44 و CD24 استخداماً في دراسات الثدي ديوان الخدمة المدنية، و CD44+/CD24– خلايا تم تعريفها الثدي CSCs26،27،،من2829 , 30-في الآونة الأخيرة، ونحن بإجراء سلسلة من التجارب تأكيد العلاقة المقترحة بين عكس المبرمج و CSCs، وتبين أن خلايا سرطان الثدي عكس المكتسبة زيادة قدرة تشكيل الورم في المختبر وفي المجراة مع نسبة مرتفعة من الخلايا مع ديوان الخدمة المدنية علامات18. على الرغم من أننا لا يمكنها استبعاد إمكانية البقاء على قيد الحياة أفضل CSCs الثدي وهكذا الحصول على إثراء بعد عكس المبرمج، الأهم من ذلك، عندما كنا عزل الخلايا الجذعية غير السرطانية والموضوع لهم بعكس المبرمج، ديوان الخدمة المدنية ستظهر في الأصل غير-الجذعية غير سرطان الخلية السكان، مما يوحي بأن الجذعية سرطان خلايا يمكن أن تسهم هذه الزيادة في النسبة المئوية ل CSCs أثناء عكس المبرمج.
هذا المقال يهدف إلى إثبات الانتقال من الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي إلى خلايا الثدي مثل ديوان الخدمة المدنية بعد عكس المبرمج والكشف عن هذا التحول بالتدفق الخلوي. وتعد الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي في البداية بعزل CD44/CD24–+ الثدي الخلايا السرطانية بنظام مراقبة الأصول الميدانية. ثم، الناجم عن المبرمج وأكدته التغييرات الشكلية تحت المجهر. بعد ذلك، تم عزلة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية الخلايا apoptotic المسمى إيجابيا بصبغ “كشف الأخضر” Caspase 3/7 ومثقف كذلك نظراً لعدم وجود مستحثات apoptotic لعكس المبرمج. ثم ملطخة الخلايا معكوسة مع علامات ديوان الخدمة المدنية بعد 7 أيام انتعاش لتحليل تدفق سيتوميتريك. خلايا CD44+/CD24– علامات تظهر من جديد في السكان المعكوسة، مما يوحي بحدوث الانتقال من الخلايا الجذعية غير السرطانية لديوان الخدمة المدنية-مثل الخلايا أثناء عكس المبرمج.
عكس المبرمج وقد لوحظ في سرطان عدة خطوط الخلايا، فضلا عن الخلايا الأولية الطبيعية تعامل مع المحفزات أبوبتوتيك مختلفة في المختبر12،13. وقد تم اقتفاء أثر هذه العملية أيضا في المورفولوجية نموذج المجراة في16،،من1719. يمكن الحصول على الكثير من المعلومات فيما يتعلق بالآلية الأساسية لانتكاس السرطان في نماذج أمراض السرطان المختلفة ومنشأ CSCs عن طريق استخدام الأسلوب كما هو موضح في هذه المخطوطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول بطريقة مباشرة وواضحة للكشف عن انتقال الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي في الثدي ديوان الخدمة المدنية-مثل الخلايا نتيجة عكس المبرمج. يمكن مساعدة تأكيدا لخصائص هذه الخلايا عكس ديوان الخدمة المدنية باستخدام أناالمختبر ن ماموسفيري تشكيل المقايسة و في فيفو إكسينو…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “صندوق التكنولوجيا المبتكرة لابتكار التكنولوجيا اللجنة”: “دعم التمويل” من الدولة مفتاح المختبر من يشكله (الصينية) ولو كو-سيونغ الصندوق البحوث الطبية الحيوية ومؤسسة هيسن لي. وأيد Y.X. سنهم بعد التخرج من المرحلة.
Materials
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
Referencias
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
- Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
- Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
- Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
- Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine). Investigación sobre el cáncer. 50 (14), 4417-4422 (1990).
- Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
- Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
- Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
- Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
- Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
- Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Investigación sobre el cáncer. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Investigación sobre el cáncer. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
- Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
- Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
- Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
- Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
- Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
- Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
- Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
- Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
- Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).
