새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Summary

여기, 선물이 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 유방암 apoptotic 세포를 분리 하 고 추가 cytometry에 의해 apoptosis 반전 후 유방암 줄기 세포와 같은 세포에 유 방 비 줄기 암 세포의 전이 감지 하는 프로토콜.

Abstract

종양학, 암 재발 오래 공부 되었습니다 기본 메커니즘 불분명 하 게 남아 있는 동안. 최근, 우리와 다른 apoptosis 반전 이라는 현상이 다른 자극 아래 다양 한 셀 모델에서 증가 tumorigenicity 리드 발견. 이전 연구 추적 생체 외에서 그리고 vivo에서;이 과정에 초점을 맞춘 되었습니다. 그러나, 진짜 반전된 셀의 절연은 아직 달성, apoptosis 반전의 결과에 대 한 우리의 이해를 제한 하 한다. 여기, 우리가 활용 Caspase-3/7 그린 감지 염료 활성화 caspases와 레이블 셀 apoptotic 유도 후. 긍정적인 신호와 셀 더 형광 활성화 된 세포 복구 (FACS)를 정렬에 의해 밖으로 정렬 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에서 형태학 시험 FACS 전에 apoptotic 상태를 확인 하는 데 도움이 됩니다. Tumorigenicity 증가 암 줄기 세포 (CSC)의 비율에 있는 상승에 종종 표시 될 수 있습니다-세포 처럼. 또한, 유방암의이 주어진,이 CSC 같은 세포의 출처를 식별 것입니다 암 치료에 중요 한. 따라서, 우리는 apoptosis를 트리거링, caspase 활성 세포를 분리 하 고 apoptosis 반전 절차를 수행 하기 전에 유방암 비 줄기 세포를 준비 합니다. 교류 cytometry 분석이 보여준다 유 방 CSC 같은 셀 유 방 CSC 같은 세포는 apoptosis 반전 동안 유방암 비 줄기 세포에서 통과할 나타내는 반전된 그룹에 다시 나타납니다. 요약 하자면,이 프로토콜 cytometry apoptotic 유방암 세포의 분리 및 반전된 셀에 CSC 비율에서 변경의 탐지를 포함 한다.

Introduction

암 국가 전세계¹무거운 부담을 일으키는 죽음의 주요 원인이 되었습니다. 유 방 암 암¹의 모든 종류 중에서 여성 환자에서 모두 발생률 및 사망률 높은 순위. 암이 성분으로 인해 약물의 조합으로 암 세포 죽음^2,,34를 달성 하기 위해 화학 요법에 사용 됩니다. 그러나, 일반적인 화학요법 약물은 종종 DNA^5,6대상, 이후 단백질 합성^7,는⁸ 또는 microtubule 역학⁹, 빠르게 성장 하는 세포는 영향을 받는 동안 대부분 암 줄기 세포 (CSC) s 등 무부하 세포는 일반적으로 덜 영향을 받는¹⁰. 따라서, CSCs는 약물 내성 및 암에는 나중에 리드^10,11재발 치료 후 생존 확률이. 따라서, CSCs의 암 치료에 대 한 중요 한 주제 되 고 CSCs의 기원 연구는 필요 하다.

Apoptosis 반전의 현상에 대 한 더 많은 연구는 최근 10 년간^{12,13,14,15,,1617,18} 에서 수행 되었습니다. ^{, 19}.이 개념의 출현 하기 전에 그것은 널리 인정 되어 셀 caspase 활성화 후 apoptosis를 받아야 돌이킬 것입니다. Caspases는 apoptotic 복잡 한 형성 및 다운스트림 기판²⁰의 분열을 포함 하 여, apoptosis의 개시 및 실행 단계에서 주요 역할을 재생 하는 단백질 효소의 가족입니다. 사형 집행 caspases caspase 3 등 7 caspase의 활성화는 “돌아올 수 없는 지점” apoptosis²¹로 간주 되었습니다. 그러나, 연구원은 최근 관찰 apoptosis 반전 둘 다 생체 외에서 발생 하 고 셀 동안 vivo에서, 는 caspase 활성화^12,,1314 이후에 apoptosis에서 복구할 수 있습니다. ^{, 15 , 16 , 17 , 18 , 19}. 또한, 적극적인 기능 반전된 암에 높은 저항 원래 apoptotic 유도 및 높은 침입을 감지와 같은 세포¹⁵. 따라서, 그것은 CSC 같은 세포의 비율 apoptosis 반전¹⁸후 더 악성 기능에 기여 하는 결국 반전 인구 치료 세포에 비해 더 높을 것 이다 제안 했다.

이전에 많은 노력 되었습니다 apoptosis 반전 생체 외에서 그리고 더 중요 한 것은, vivo에서, 추적 하이 과정^16,,1719의 보편성을 확인에 도움이 크게. 그러나, 반전된 셀의 결과 대 한 체계적 연구 진정으로 apoptosis 반전 받은 셀 럽 격리 때문 부족 이다. 순수한 apoptotic 세포를 확보 하 고 추가 연구에 대 한 그들을 복구할 필요가 있다. 따라서, apoptosis에 대 한 “돌아올 수 없는 지점”²¹ 의 표식으로 사형 집행 caspase 활성화의 전통적으로 잘 받아들여 마커를 사용 하 고 형광 활성화 셀 정렬 caspase 활성 셀 스테인드 차별 (FACS)를 활용 Caspase-3/7 그린 검출의 염료와 염료 covalently DEVD 인식 하 고 활성 caspases 3/7에 의해 죽 습 수 있는 짧은 아미노산 시퀀스에 연결 됩니다. 분열 핵 어디 그것은 DNA에 바인딩하고 강한 형광을 방출 하는 cytosol에서 이동 것 이다 염료를 해제 하는 데 도움이 됩니다. 이 절차는 일부 셀 수 없는 받은 apoptosis 대량 세포 인구를 사용 하 여 피할 수 있습니다.

CSCs 또는 종양 시작 셀 하나를 사용 하 여 많은 단단한 종양에서 발견 되었습니다 또는 여러 표면 marker(s)와이 세포의 거의 숫자의 조합 형태로 종양 immunodeficient 쥐^{22,23, 충분 한 24,25,,2627}. CD44 CD24의 조합 일반적으로 사용 되었습니다 가슴 CSC 연구와 CD44⁺/CD24^– 세포 유 방 CSCs^26,27,,2829 으로 정의 된 ^{, 30}. 최근, apoptosis 반전와 CSCs 제안 된 관계를 확인 하 고 반전된 유방암 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서와 증가 종양 형성 능력을 얻은 것을 입증 하는 실험의 일련을 수행 했습니다 우리는 CSC 마커¹⁸셀의 높은 백분율. 우리 유 방 CSCs 더 나은 생존과 따라서 얻을 농축 apoptosis 반전 후 중요 한 것은, 우리가 비 줄기 세포 및 주제를 분리 하는 경우 가능성을 제외 하지 수 있지만 그들 apoptosis 반전, CSC는 원래 비-줄기에 나타날 것입니다. 암 세포 인구, 제안 하는 비-줄기 암 세포 apoptosis 반전 동안 CSCs의 비율에 있는 증가에 기여할 수 있다.

이 문서는 apoptosis 반전 후 유 방 CSC 같은 셀에 유방암 비 줄기 세포에서 전환 설명 cytometry 여이 변화를 감지 하 고 목표로 하고있다. 유 방 비 줄기 암 세포는 처음 CD44 분리 하 여 준비^–/CD24⁺ FACS에 의해 암 세포 유 방. 다음, apoptosis 유도 이며 현미경 형태학 변화에 의해 확인. 이후에, apoptotic 세포 Caspase 3/7 그린 감지 염료에 의해 긍정적으로 표시 FACS에 의해 격리 되며 추가 apoptotic apoptosis 반전에 대 한 inducers의 부재에서 경작. 반전된 셀 다음 흐름 cytometric 분석에 대 한 복구의 7 일 후 CSC 마커 얼룩이 있습니다. CD44 셀⁺/CD24 전환 비 줄기 암 세포에서 CSC 같은 세포 apoptosis 반전 하는 동안 발생 했습니다 제안^– 마커 다시 반전된 인구에 표시.

Apoptosis 반전 여러 암에 관찰 된 세포 뿐만 아니라 정상적인 1 차 셀 체 외^12,13다른 apoptotic 자극으로 치료. 이 과정 또한 초파리 에 추적 되었다 vivo에서^16,,1719모델. 이 원고에 설명 된 대로 기술을 사용 하 여 다른 암 질환 모델 및 CSCs의 암 재발의 기본 메커니즘에 대 한 많은 정보를 얻을 수 있습니다.

Protocol

1. 유 방 암 세포를 비 줄기 의 준비 문화 MCF-7 고 페 놀 레드 무료 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 100 mm 접시에 보충의 10 mL에 MDA-MB-231 셀. 문화 T47D 10ml 2 m L-글루타민 보충 페 놀 레드 무료 RPMI 1640 매체에에서, 10% 열-비활성화 FBS, 및 1 %v / v 100 mm 접시에 페니실린 스 (PS). 문화는 5% CO2/95% 공기 세포 문화 인큐베이터에서 37 ° C?…

Representative Results

전환 가슴에서 유 방 CSC 같은 셀, CD44의 첫 번째 정렬 비 줄기 암 세포를 관찰 하기 위해-/CD24+ 유방암 세포 필요 했다. MCF-7 셀 라인을 약 0.15% 원래 인구 (그림 1),이 단계에서에서 CSC 표식이 있는 셀 있었습니다 apoptosis 반전 하는 동안 CSC 농축의 가능성을 제외. 그와 반대로, 원래 인구에서 CSC 표식이 있는 셀을 확인 하 고 있었다와 같은 …

Discussion

이 프로토콜 apoptosis 반전으로 인해 유 방 CSC-같은 세포로 유방암 비 줄기 세포의 변화를 탐지 하기 위한 직접적이 고 명확한 방법을 설명 합니다. 이러한 반전된 셀의 CSC 속성의 확인 in vitro mammosphere 형성 분석 결과 그리고 vivo에서 이 종이 식 이식 immunodeficient 쥐^{18,24,26 사용 하 여 지원 될 수 있습니다. ,}<su…

Materials

MCF-7	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-22
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
T47D	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate	Invitrogen	A35109
bovine serum albumin	USB	9048-46-8
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye	Invitrogen	C10423
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Fc block	Miltenyi Biotec	130-059-901
fetal bovine serum	Invitrogen	16000044	heat-inactivated
HEPES	USB	16926
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
L-glutamine	Invitrogen	25030081
Mitotracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512
monoclonal antibodies against human CD24	BD Biosciences	555428	PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44	BD Biosciences	560531	PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	554648	Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	558304	Clone:27-35 RRID:AB_647257
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	21600010
propidium iodide	Invitrogen	P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium	Invitrogen	11835055	phenol red-free
sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
staurosporine	Sigma-Aldrich	S4400
Equipment
100 mm culture dish	Greiner Bio-One	664160
12-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	150628
Cell Strainer 40-μm nylon mesh	BD Biosciences	08-771-1
FACSuite software bundle v1.0	BD Biosciences	651360
FACSVerse	BD Biosciences	651155
FluoView FV1000 confocal microscope	Olympus	IX81	60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b	Olympus	–
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes	BD Biosciences	352003
S3e sorter	Bio-Rad	1451006