聚乙胺包覆氧化铁纳米粒子作为载体, 在体外和体内向巨噬细胞输送小干扰 rna
Summary
我们描述了一种使用聚乙烯烯胺 (pei) 涂层超顺磁性氧化铁纳米粒子与 sirna 转染巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可以有效地传递 sirna 巨噬细胞在体外和体内和沉默目标基因表达。
Abstract
巨噬细胞由于在调节免疫反应方面的关键作用, 一直是深入研究的对象, 在自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症等许多疾病中都是一个有希望的治疗目标。rnai 介导的基因沉默是探索和操纵巨噬细胞功能的一种有价值的选择方法;然而, 巨噬细胞与 sirna 的转染通常被认为是技术上具有挑战性的, 目前, 很少有专门用于 sirna 转移到巨噬细胞的方法。在这里, 我们提出了一个协议, 使用聚乙烯烯胺涂层超顺磁性氧化铁纳米粒子 (pei-spions) 作为有针对性地传递 sirna 到巨噬细胞的载体。当 fe: sirna 重量比达到4及以上时, pei-spions 能够结合并完全冷凝 sirna。在体外, 这些纳米粒子可以有效地将 sirna 传递到初级巨噬细胞中, 也可以传递到类似巨噬细胞的 raw 264.7 细胞系中, 而不会在最佳转染剂量下损害细胞活力, 最终, 它们会诱发sirna 介导的靶向基因沉默。除了用于体外sirna 转染外, pei-spion 也是一种很有前途的工具, 可将sirna 传递给体内的巨噬细胞。鉴于其磁性能和基因沉默能力的综合特点, 系统管理的 pei-spion/srna 颗粒不仅可以调节巨噬细胞的功能, 而且可以使巨噬细胞被成像和跟踪。从本质上讲, pei-spions 代表了一个简单、安全和有效的非病毒平台, 用于在体外和体内将 sirna 传递给巨噬细胞。
Introduction
巨噬细胞是一种分布在所有身体组织中的先天免疫细胞, 尽管数量不同。通过产生多种细胞因子和其他介质, 它们在宿主防御入侵微生物病原体、损伤后组织修复和维持组织稳态1方面发挥着至关重要的作用。巨噬细胞由于其重要性, 一直是深入研究的主题。然而, 尽管 sirna 介导的基因沉默在基因调控和功能研究中很普遍, 但它在巨噬细胞中成功的可能性较小, 因为这些细胞–特别是初级巨噬细胞–往往难以转染。这可归因于与最成熟的转染方法相关的毒性相对较高, 在这种方法中, 细胞膜是化学的 (例如, 与聚合物和脂质的) 或物理的 (例如, 通过电穿孔和基因枪) 被破坏, 让 sirna 分子穿过膜, 从而极大地降低了巨噬细胞的生存能力2,3。此外, 巨噬细胞是富含降解酶的专用吞噬细胞。这些酶会损害 sirna 的完整性, 削弱其沉默效率, 即使基因特异性 sirna 已被传递到细胞3,4。因此, 一个有效的巨噬细胞靶向 sirna 传递系统需要在传递过程中保护 sirna 的完整性和稳定性4。
越来越明显的是, 功能失调的巨噬细胞与某些常见临床疾病 (如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症) 的发生和发展有关。因此, 调节巨噬细胞功能, 例如, sirna, 已经成为一种有吸引力的方法来治疗这些疾病5, 6,7.虽然已经取得了很大进展, 但基于 sirna 的治疗策略的一个主要挑战是系统管理的 sirna 的细胞特异性差, 巨噬细胞的 sirna 吸收不足, 从而导致不受欢迎的副作用。与游离核酸疗法相比, 由于其自发倾向于被网状内皮系统捕获, 通常缺乏最佳的细胞选择性, 并经常导致离靶不良效应, 药物负载纳米粒子 (nps),可设计为在体内被动靶向巨噬细胞, 允许提高治疗效果与最小的副作用8。目前探索的用于传递 rna 分子的 np 包括无机纳米载体、各种脂质体和聚合物9。其中, 聚乙基烯胺 (pei) 是一种能够将核酸结合并凝结成稳定的 np 的阳离子聚合物, 它显示出最高的 rna 传递能力9,10。pei 保护核酸免受酶和非酶降解, 介导它们在细胞膜上的转移, 并促进它们在细胞内的释放。虽然最初作为 dna 传递试剂引入, pei 后来被证明是一个有吸引力的平台, 在本地或系统 9,10体内 sirna 传递。
超顺磁性氧化铁纳米粒子 (spions) 由于其磁性能、生物相容性、与生物重要物体的可比尺寸、较高的表面积与体积比以及易于适应的特性, 在生物医学领域显示出巨大的前景表面活性剂附件11的表面。例如, 由于 spions 作为造影剂的潜在效用和巨噬细胞的快速吸收, 已成为一种最受欢迎的临床工具, 可对巨噬细胞进行成像。虽然 spions 也被广泛研究为核酸交付车辆11,13,14, 15,据我们所知, 文献中很少有关于 spions 作为载体的报告。巨噬细胞靶向 sirna 的传递。对于 spions 的基因传递, 它们的表面通常涂有一层亲水阳离子聚合物, 负电荷核酸可以被静电吸引和捆绑在上面。在这里, 我们提出了一种方法, 合成 spions 的表面被修改与低分子量 (10 kda), 分枝 pei (pei-spions)。然后利用这些磁性纳米平台浓缩 sirna, 形成 pei-spion/sirna 复合物, 使 sirna 能够进入细胞。我们认为, 网状内皮系统16细胞自发吞噬的 spions, 再加上 pei 结合和凝结核酸的强大能力, 使得 pei-spions 适合有效地将 sirna 运进 sirna巨 噬 细胞。这里提供的数据支持了 pei-spion/sina 介导的基因沉默在培养和体内巨噬细胞中的可行性。
Protocol
Representative Results
Discussion
巨噬细胞很难通过常用的非病毒方法进行转染, 如电穿孔、阳离子脂质体和脂质种。在这里, 我们描述了一个可靠和有效的方法来转染巨噬细胞与 sirna。使用目前的协议, 90% 以上的巨噬细胞样 raw 264.7 细胞 (图 2b) 和大鼠腹腔巨噬细胞18可以用 sirna 转染, 而不会对细胞的存活能力造成重大损害。该方法依赖于由氧化铁芯和 pei 壳组成的纳米载体–的输送平台 pei-s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金 (81772308) 和国家重点研究开发计划 (编号: 2017yfa0205502) 的支持。
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
Referencias
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