Un análisis de transporte de la rodopsina por análisis de la proyección de imagen de alto contenido
Summary
Aquí, describimos un método de imagen de alto contenido para cuantificar el transporte de los mutantes de la rodopsina asociada con retinitis pigmentosa. Un análisis de puntuación de múltiple longitud de onda se utilizó para cuantificar la proteína rodopsina en la superficie celular o en la célula entera.
Abstract
Rhodopsin causa mutaciones conducen a la muerte de fotorreceptores de varilla que se manifiesta como un autosoma dominante pigmentosa de la retinitis (RP), una progresiva ceguera que carece de tratamiento eficaz. Presumimos que la citotoxicidad de los mutantes de la rodopsina mal plegadas puede ser aliviada por farmacológicamente estabilización de la proteína rodopsina mutante. La mutación P23H, entre las otras mutaciones de la rodopsina de clase II, codifica una proteína mutante de rodopsina estructuralmente inestables que se acumula en el retículo endoplásmico (ER), mientras que la rodopsina de tipo salvaje es transportada a la membrana plasmática en mamíferos células. Realizamos previamente una pantalla basada en la luminiscencia de alto rendimiento (HTS) e identificó un grupo de chaperonas farmacológicas que rescató el transporte de la rodopsina P23H de ER a la membrana plasmática. Aquí, usando un método de immunostaining seguido de un análisis de proyección de imagen de alto contenido, cuantificar la cantidad de la proteína rodopsina mutante en la célula entera y en la membrana plasmática. Este método es informativo y eficaz para identificar los verdaderos éxitos de falsos positivos después de HTS Además, el análisis de imágenes de alto contenido permitió cuantificar parámetros múltiples de un solo experimento para evaluar las propiedades farmacológicas de cada compuesto. Usando este análisis, se analizó el efecto de 11 diferentes compuestos hacia seis mutantes de rodopsina RP asociada, obteniendo un perfil farmacológico del 2-D para una comprensión cuantitativa y cualitativa acerca de la estabilidad estructural de estos mutantes de la rodopsina y eficacia de los diferentes compuestos a estos mutantes.
Introduction
Mal plegamiento de la proteína está implicada en la distrofia muscular, degeneraciones neuronales, así como enfermedades cegadoras, incluida la retinitis pigmentosa (RP)1. RP es una degeneración retiniana hereditaria y progresiva asociada a mutaciones en más de 60 genes que afectan a la función y la homeostasis de los fotorreceptores de la barra o la retina pigmentada epitheliums (RPEs)2,3. No hay tratamiento eficaz está disponible para RP. Rhodopsin mutaciones representan alrededor del 25-30% de autosómica dominante (ad) casos RP. Entre los más de 150 rodopsina mutaciones4 (humano Gene mutación de base de datos, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), las mutaciones clase II causan la inestabilidad estructural de la proteína rodopsina que contribuye a la muerte de fotorreceptores de varilla y pérdida visión5,6,7,8. El P23H es la mutación más frecuente de la rodopsina en América del norte, que también es un ejemplo típico de la clase II la rodopsina mutaciones9,10. Debido a su inestabilidad estructural inherente, la rodopsina mal plegada se acumula en el retículo endoplásmico (ER) en células de mamíferos, mientras que el tipo salvaje la rodopsina se encuentra en la membrana plasmática5. La rodopsina misfolded P23H exposiciones mutante dominante negativo citotoxicidad no por haploinsufficiency, pero se relaciona con la activación de ER asociados vía de degradación de proteínas y la organización del segmento externo de varilla interrumpida. Para aliviar el estrés de barra fotorreceptor de la célula, una estrategia es estabilizar el plegamiento nativo de la rodopsina mutante con un chaperonas farmacológicas.
Para lograr este objetivo, se realizó una pantalla de alto rendimiento basado en la célula (HTSs)11,12,13 utilizando un ensayo de complementación de fragmento de β-galactosidasa para cuantificar al mutante de rodopsina P23H transportado en el plasma membrana. El Protocolo simple y robusto de este ensayo HTS nos permitió explorar las actividades de unos 79.000 moléculas pequeñas para cada pantalla. Sin embargo, dado que este ensayo HTS Lee las señales de luminiscencia, falsos positivos, incluyendo los inhibidores de β-gal, compuestos coloreados o citotóxicos están incluidos en la lista esperando ser identificado por un análisis secundario.
El immunostaining tradicional y métodos de proyección de imagen de fluorescencia han utilizado durante años para estudiar el transporte de la rodopsina en las células mamíferas5,14,15,16. Sin embargo, estos métodos convencionales no pueden utilizarse para cuantificar los efectos farmacológicos de más de 10 compuestos hacia transporte de rodopsina porque un análisis fiable de imágenes requiere un gran número de imágenes tomadas bajo una condición altamente consistente, que es no modificable por los métodos convencionales de la proyección de imagen. Aquí, hemos desarrollado un protocolo de imagen de alto contenido de immunostaining basado en como un análisis secundario para cuantificar el transporte de superficie de célula de misfolded rodopsina mutantes11,13,17. Para etiqueta de rodopsina en la membrana de plasma, nos hemos saltado el paso de permeabilización de la membrana de la célula y immunostained los mutantes de la rodopsina por una monoclonal (B6-30) contra la rodopsina reconoce el epitopo del N-terminal de la rodopsina en el lado extracelular de la célula membrana18. Para visualizar la rodopsina mutante en la célula entera, nos fundió rodopsina con la proteína de la fluorescencia de Venus. Por la cuantificación de las intensidades de fluorescencia en canales diferentes de la fluorescencia, que son capaces de obtener varios parámetros de un experimento único, incluyendo la intensidad total de la rodopsina en las células enteras, sobre la superficie de la célula y la relación de fluorescencia de la rodopsina en la superficie celular para en la célula entera. Aplicar este método para estabilizar las células expresan un total de seis mutantes de rodopsina mal plegadas, podemos generar un perfil farmacológico de varias pequeñas moléculas chaperonas hacia estos mutantes. En este protocolo, todas las células son immunostained en una placa de 384 pozos y reflejada usando un sistema automatizado de proyección de imagen bajo una condición de proyección de imagen altamente consistente. Se realiza un análisis de la imagen a cada pocillo, que contiene imágenes de más de 600 celdas para reducir variación debido a la heterogeneidad de las células con diferentes nivel de expresión de proteína y forma celular. El flujo de trabajo de este protocolo se resume en la figura 1. La ventaja de este método es que obtenemos imágenes de alta resolución así como cuantificaciones de múltiples parámetros del análisis basado en imágenes. En general, este protocolo puede ser modificado y aplicado para cuantificar el transporte de cualquier proteína de la membrana mal plegadas de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, mostramos un análisis de imagen de alto contenido utilizado para caracterizar hits identificados de un HTS La automatización única en estos protocolos es el reproductor de imágenes de alto contenido. El immunostaining y proyección de imagen de la fluorescencia de la rodopsina se han utilizado comúnmente para caracterizar la localización de la rodopsina5,14,15,16. Sin embargo, la c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Mark E. Schurdak y descubrimiento de fármacos de la Universidad de Pittsburgh para proporcionar las imágenes de alto contenido y formación inicial. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) generosamente compartida la 4 1 y los anticuerpos anti-rodopsina B630. El plásmido que contiene el cDNA del constructo de Venus rodopsina de ratón fue compartido por el Dr. Nevin Lambert (Universidad de Augusta). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de concesión de la salud EY024992 YC y P30EY008098 de grant de la Universidad de Pittsburgh visión investigación base.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
Referencias
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Bioquímica. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
