Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie
Summary
Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.
Abstract
In levende cellen betrokken processen zoals hechting vorming uitgebreide structurele veranderingen in het plasma-membraan en het interieur van de cel. Om te visualiseren deze hoogdynamische gebeurtenissen, twee complementaire lichte microscopie technieken waarmee snelle beeldvorming van live monsters werden gecombineerd: draaiende schijf microscopie (SD) voor snelle en hoge resolutie opname en totale interne reflectie de microscopie van de fluorescentie (TIRF) voor precieze lokalisatie en visualisatie van het plasma-membraan. Een uitgebreide en volledige imaging protocol wordt getoond voor begeleiden door bereiding van de monsters, Microscoop kalibratie, beeldvorming en overname, wat resulteert in meerdere kleuren SD-TIRF levende imaging serie met hoge spatio-temporele resolutie. Alle nodige afbeelding nabewerking stappen voor het genereren van de multi-dimensionale levende imaging datasets, d.w.z. de registratie en de combinatie van de afzonderlijke kanalen, vindt u in een zelfgeschreven macro voor de open sourcesoftware ImageJ. De beeldvorming van fluorescente proteïnen tijdens initiatie en rijping van hechting complexen, alsmede de vorming van het cytoskeletal netwerk van actine, werd gebruikt als een bewijs van beginsel voor deze nieuwe aanpak. De combinatie van hoge resolutie 3D microscopie en TIRF verstrekt een gedetailleerde beschrijving van deze complexe processen binnen de cellulaire omgeving en, tegelijkertijd, precieze lokalisatie van de membraan-geassocieerde moleculen met een hoog ontdekt verhouding signaal-naar-achtergrond.
Introduction
Onze dagen, de lichte microscopie technieken bieden hoge/super resolutie beeldvorming in vaste en levende specimen evolueren snel. Super resolutie technieken zoals gestimuleerd emissie uitputting (STED), gestructureerd verlichting microscopie (SIM) en foto-activering lokalisatie microscopie (PALM) of directe stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM), respectievelijk, zijn verkrijgbare en inschakelen van de beeldvorming van subcellular structuren details weergeven bijna op de moleculaire schaal1,2,3,4,5,6. Deze benaderingen nog steeds hebben echter slechts beperkt toepasbaarheid voor levende imaging experimenten waarbij grote hoeveelheden moeten worden gevisualiseerd met meerdere beelden per tweede overname snelheid. Soorten hoogdynamische processen geregeld via het plasma-membraan, bijvoorbeeld endo- / exocytose, hechting, migratie of signalering, optreden met hoge snelheid binnen grote cellulaire volumes. Onlangs, was een geïntegreerde microscopie techniek om te vullen deze kloof, voorgestelde genaamd draaiende schijf-TIRF (SD-TIRF)7. In detail vliegvergunningen TIRF microscopie specifiek isoleren en lokaliseren van het plasmamembraan8,9, terwijl SD microscopie een van de meest gevoelige en snel is leven beeldvormingstechnieken voor de visualisatie en tracking van subcellular organellen in het cytoplasma10,11. De combinatie van beide beeldvormingstechnieken in een enkele setup is al gerealiseerd in de afgelopen12,13, echter de Microscoop gepresenteerd hier (figuur 1) tot slot voldoet aan de criteria voor het uitvoeren van levende imaging SD-TIRF-experimenten van de bovengenoemde processen ter 3 raamwindow via tweede snelheid. Aangezien deze Microscoop commercieel beschikbaar is, wordt het doel van dit manuscript te beschrijven in detail en open source tools en protocollen voorzien in Beeldacquisitie, registratie en visualisatie SD-TIRF microscopie gekoppeld is.
De setup is gebaseerd op een omgekeerde Microscoop verbonden met twee scan eenheden via autonome havens – de linker poort is gekoppeld aan de eenheid van de SD en de achterste poort scannereenheid voor TIRF en foto-activation /-bleken experimenten. Maximaal 6 lasers (405/445/488/515/561/640 nm) kan worden gebruikt voor excitatie. Excitatie en opsporing van het signaal van de fluorescentie, ofwel een 100 x / NA1.45 olie of 60 x / NA1.49 olie TIRF doelstelling, respectievelijk, zijn tewerkgesteld. Het uitgestraalde licht is gesplitst door een dichroïde spiegel (561 nm long pass of 514 nm long pass) en gefilterd door diverse band pass filters (55 nm breed gecentreerd op 525 nm, 54 nm breed gecentreerd op 609 nm voor groene en rode fluorescentie, respectievelijk) geplaatst voor de twee EM-CCD-cam tijdperken. Houd er rekening mee dat er meer technische details over de setup staan in Zobiak et al. 7. in TIRF de configuratie, de SD-eenheid wordt verplaatst vanuit het licht pad binnen circa 0,5 s zodat het dezelfde twee camera’s kunnen worden gebruikt voor de detectie, waardoor sneller schakelen tussen de twee beeldvormende modaliteiten vergeleken met circa 1 s dat werd gerapporteerd in het verleden13 . Deze functie mogelijk maakt dual channel gelijktijdige overname, dus 4 kanalen SD-TIRF denkbaar ter eerder ongeëvenaarde snelheid en nauwkeurigheid kan worden uitgevoerd. Bovendien is de uitlijning tussen SD en TIRF beelden overbodig. Uitlijning van afbeelding tussen de twee camera’s, maar moet worden gecontroleerd voordat het experiment en eventueel worden hersteld. In het volgende protocol, werd een registratie correctie routine geïmplementeerd in een zelfgeschreven ImageJ macro. Bovendien, de macro werd voornamelijk ontworpen om een gelijktijdige visualisatie van SD- en TIRF datasets ondanks hun verschillende dimensionaliteit. De acquisitie software zelf hebben deze functies niet verstrekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze paper werd de eerste succesvolle implementatie van SD en TIRF microscopie in een configuratie die geschikt zijn voor het uitvoeren van de levende cel imaging experimenten, dat wil zeggen hoge acquisitie tarieven zoals 2 SD-TIRF-afbeeldingsstapels per minuut 3 verschillende stadium gepresenteerd posities, overeenkomend met in totaal 168 frames (circa 3 beelden per seconde), werden verworven. De paar SD-TIRF-microscopen die waren eerder beschreven12,13</…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken sterk de wetenschappers van de University Medical Center Hamburg-Eppendorf voor het steunen van ons met monsters voor evaluatie. Namelijk, wij danken Sabine Windhorst voor NIH3T3 cellen, Andrea Mordhorst voor YFP-Vinculin en Maren Rudolph voor RFP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Referencias
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
