Micronisation mécanique de Lipoaspirates pour la thérapie régénérative

Summary

Nous présentons ici un protocole pour obtenir la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux grâce à une série de procédés mécaniques, incluent l’émulsification et plusieurs centrifugations.

Abstract

Stroma vasculaire fraction (SVF) est devenu un outil régénératrice pour diverses maladies ; Cependant, la législation réglemente strictement l’application clinique des produits cellulaires à l’aide de la collagénase. Nous présentons ici un protocole visant à générer un mélange injectable de cellules SVF et native matrice extracellulaire du tissu adipeux par un procédé purement mécanique. Lipoaspirates sont placés dans une centrifugeuse et filés à 1 200 x g pendant 3 min. La couche intermédiaire est recueillie et séparée en deux couches (graisses haute densité en bas) et faible densité sur le dessus. La couche supérieure est directement émulsifiée par transfert intersyringe, à raison de 20 mL/s pour 6 x à 8 x. La graisse émulsionnée est centrifugée à 2 000 x g pendant 3 min, et la substance collante sous la couche d’huile est recueillie et définie comme la matrice extracellulaire (ECM) / SVF-gel. L’huile sur la couche supérieure est recueillie. Environ 5 mL d’huile est ajouté à 15 mL de graisse à haute densité et émulsionnée en décalant intersyringe, à raison de 20 mL/s pour 6 x à 8 x. La graisse émulsionnée est centrifugée à 2 000 x g pendant 3 min, et la substance collante est aussi ECM/SVF-gel. Après la greffe de l’ECM/SVF-gel sur des souris Nudes, le greffon est récolté et évalué par l’examen histologique. Le résultat montre que ce produit a le potentiel pour se régénérer dans le tissu adipeux normal. Cette procédure est une procédure de dissociation mécanique simple et efficace de condenser les cellules SVF incorporés dans leur ECM soutien naturel à des fins de récupération.

Introduction

Cellules souches offrent un changement de paradigme pour la régénération et la réparation des tissus, afin qu’ils puissent offrir un autre schéma thérapeutique pour diverses maladies¹. Les cellules souches (par exemple, les cellules souches pluripotentes induites et les cellules souches embryonnaires) ont un grand potentiel thérapeutique, mais sont limités en raison de la régulation cellulaire et des considérations éthiques. Dérivé d’adipeux mésenchymateuses stromales/cellules souches (ASCs) sont faciles à obtenir de lipoaspirates et pas soumis aux mêmes restrictions ; ainsi, il est devenu un type de cellule idéal pour la pratique de la médecine régénérative,². En outre, ils sont nonimmunogenic et disposent de ressources abondantes de graisse autologue³.

Actuellement, CRA est obtenus principalement par digestion de collagénase médiée par du tissu adipeux. La fraction stroma vasculaire (SVF) du tissu adipeux contient NASC, cellules endothéliales, péricytes et cellules immunitaires. Bien que l’obtention d’une haute densité de SVF/CRA enzymatiquement s’est avéré avoir des effets bénéfiques, la législation de plusieurs pays réglemente strictement l’application clinique des produits à base de cellules à l’aide de collagénase⁴. Digérer le tissu adipeux avec la collagénase pendant 30 min à 1 h pour obtenir les cellules SVF augmente le risque de ces deux matières exogènes dans la préparation et la contamination biologique. La culture adhérente et la purification des CRA, qui prend les jours de semaines, exigent l’équipement de laboratoire spécifiques. En outre, dans la plupart des études, des cellules SVF et CRA est utilisés en suspension. Sans la protection de la matrice extracellulaire (mec) ou un autre transporteur, cellules libres sont vulnérables, provoquer une rétention d’une pauvre cellule après l’injection et compromettre le résultat thérapeutique⁵. Toutes ces raisons limitent l’autre demande de thérapie de cellules souches.

Pour obtenir des CRA du tissu adipeux sans digestion induite par la collagénase, plusieurs procédures de traitement mécanique, y compris de centrifugation, mécanique, hacher, broyer, réduire en purée et hacher, ont été développés^{6,7 , 8 , 9}. ces méthodes sont censés se condensent les tissus et CRA en perturbant mécaniquement les adipocytes matures et leurs vésicules contenant de l’huile. En outre, ces préparations, contenant des concentrations élevées des CRA, a montré un potentiel thérapeutique considérable comme médecine régénérative des animaux modèles^8,9,10.

En 2013, Tonnard et coll. a présenté le nanofat technique, qui consiste à produire lipoaspirates émulsifiée par intersyringe traitement de¹¹de greffage. La force de cisaillement créée par intersyringe déplacement peut briser sélectivement les adipocytes matures. Se fondant sur leurs constatations, nous avons développé une méthode de traitement purement mécanique qui élimine la plupart des lipides et fluide dans les lipoaspirates, laissant seulement les cellules SVF et fractionné ECM, qui est ECM/SVF-gel¹². Ici, les auteurs décrivent les détails du processus mécanique d’origine humaine de tissus adipeux pour produire l’ECM/SVF-gel.

Protocol

Cette recherche a été approuvée par la Commission d’examen éthique dans l’hôpital Nanfang, Guangzhou, Chine. Le tissu adipeux a été prélevé de donneurs sains qui a donné consentement éclairé pour participer à l’étude. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de Nanfang hôpital Institutional Animal Care et effectuées conformément aux lignes directrices de la National Health and Medical Research Council (Chine). 1. ECM/SVF-g…

Representative Results

Après le traitement de la graisse de Coleman à ECM/SVF-gel, le volume d’huile mis au rebut reprend 80 % du volume final, et seulement 20 % du tissu adipeux, conservé sous la couche d’huile est considérée comme ECM/SVF-gel (Figure 1A). ECM/SVF-gel a une texture liquide lisse qui lui permet de passer par une fine aiguille 27 G ; Cependant, graisse de Coleman se compose d’une structure adipeuse intégrale avec des fibres de gros et n…

Discussion

Sur les cellules souches de thérapie régénérative a montré un grand bénéfice potentiel dans différentes maladies. CRA est les candidats thérapeutiques exceptionnels parce qu’ils sont faciles à obtenir et ont la capacité de réparation tissulaire et la régénération des tissus nouveaux¹⁵. Cependant, il y a des limites à l’élargissement de son application clinique, car cela nécessite des procédures complexes d’isoler les cellules et collagénase de traitement^…

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus