المعايرة وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا
Summary
يصف لنا طريقة بسيطة للقياس الكمي السريع من وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا المتنوعة، بما في ذلك الأنواع المتفطرات إيجابية وسلبية الغرام.
Abstract
وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوي (سليلة) بوليمر بيولوجية الموجودة في الخلايا من جميع مجالات الحياة، ومطلوب من أجل الفوعة وإجهاد استجابة في العديد من البكتيريا. وهناك مجموعة متنوعة من أساليب لتحديد سليلة في المواد البيولوجية، والعديد منها كثيفة العمالة أو غير حساسة، يحد من فائدتها. نقدم هنا طريقة مبسطة للقياس الكمي سليلة في البكتيريا، تستخدم استخراج عمود غشاء والسليكا الأمثل للمعالجة السريعة لعينات متعددة والهضم من سليلة مع اكسوبوليفوسفاتاسي الخاصة سليلة سكبكس، والكشف عن فوسفات الحرة الناتجة مع مقايسة اللونية حساسة على أساس حمض الأسكوربيك. هذا الإجراء مباشرة، وغير مكلفة، ويسمح سليلة موثوقية القياس الكمي في مختلف أنواع الجراثيم. نقدم الكمي سليلة الممثل من بكتيريا سلبية الغرام (الإشريكيّة القولونية) وبكتيريا حمض الالكتيك إيجابية (ريوتيري اكتوباكيللوس)، والأنواع المتفطرات (بكتريا سميجماتيس). نحن تشمل أيضا بروتوكول بسيط لتنقية النيكل تقارب كميات مغ من سكبكس، التي ليست متاحة تجارياً حاليا.
Introduction
وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوي (سليلة) هو بيوبوليمير خطية وحدات الفوسفات المرتبطة فوسفوانهيدريدي موجودة في جميع مجالات الحياة1،،من23. في البكتيريا المتنوعة، سليلة ضروري لاستجابة الإجهاد وحركية وتشكيل بيوفيلم، مراقبة دورة الخلية، ومقاومة المضادات الحيوية والفوعه4،5،،من67،8 9، ،،من1011. ولذلك قد دراسات الأيض سليلة في البكتيريا يمكن أن تسفر عن الأفكار الأساسية في قدرة البكتيريا تسبب المرض وتزدهر في بيئات متنوعة. في كثير من الحالات، ومع ذلك، الأساليب المتوفرة لتحديد سليلة في الخلايا البكتيرية عاملاً مقيداً في هذه الدراسات.
وهناك العديد من الطرق المستخدمة حاليا لقياس مستويات سليلة في المواد البيولوجية. عادة ما تشمل هذه الأساليب خطوتين متمايزتين: استخراج سليلة والتحديد الكمي سليلة موجودة في تلك المقتطفات. طريقة معيار الذهب الحالية، وضعت للخميرة Saccharomyces cerevisiae Bru والزملاء في12، سليلة مقتطفات جنبا إلى جنب مع الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي باستخدام الفينول وكلوروفورم، تليها الإيثانول هطول الأمطار، المعاملة مع deoxyribonuclease (الدناز) وريبونوكليسي (رناسي)، والهضم من سليلة المنقي الناتج مع S. cerevisiae اللاإنسانية سليلة إنزيم اكسوبوليفوسفاتاسي (سكبكس)13 لإنتاج الفوسفات مجاناً، والتي يتم بعد ذلك كمياً باستخدام الملكيت الأخضر-على أساس مقايسة اللونية. هذا الإجراء الغاية الكمية لكن كثيفة العمالة، مما يحد من عدد العينات التي يمكن معالجتها في تجربة واحدة، وليس الأمثل للعينات البكتيرية. وقد أبلغ آخرون استخراج سليلة من مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة باستخدام الخرز السليكا (“جلاسميلك”) أو السليكا غشاء الأعمدة6،،من1415،16،17، 18. هذه الأساليب لا كفاءة استخراج سلسلة قصيرة سليلة (أقل من 60 وحدة الفوسفات)12،،من1415، على الرغم من أن هذا أقل قلقا للبكتيريا، والتي يعتقد عموما أن توليف أساسا 3من سليلة سلسلة طويلة. الأساليب القديمة لاستخراج سليلة استخدام الأحماض القوية19،20 لم تعد تستخدم على نطاق واسع، منذ سليلة غير مستقرة تحت الظروف الحمضية12.
وهناك أيضا مجموعة متنوعة من أساليب سليلة تحديد المبلغ عنها. ومن بين الأكثر شيوعاً هو 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، صبغة فلورسنت أكثر عادة ما تستخدم لوصمة عار الحمض النووي. المجمعات سليلة DAPI لها الأسفار المختلفة ماكسيما الإثارة والانبعاثات من الحمض النووي DAPI مجمعات21،22، لكن هناك تدخل كبير من المكونات الخلوية الأخرى، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي والنيوكليوتيدات الإينوزيتول الفوسفات12،،من1516،23، الحد من خصوصية وحساسية من سليلة القياسات باستخدام هذا الأسلوب. بدلاً من ذلك، يمكن تحويل سليلة و diphosphate الأدينوزين (ADP) إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) استخدام المنقي الإشريكيّة القولونية سليلة كيناز (PPK) و ATP الناتجة كمياً باستخدام لوسيفراس14،17 ،18. وهذا يتيح الكشف عن كميات صغيرة جداً من سليلة، ولكن يتطلب خطوتين رد الفعل الأنزيمي ولوسيفرين وشرطة نقية جداً، التي هي الكواشف باهظة الثمن. سكبكس تحول دون التحديد النبذ سليلة إلى فوسفات حرة6،،من1213،24، التي يمكن الكشف عنها باستخدام طرق أبسط، ولكن سكبكس ب الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي12، مقتطفات الدناز يستلزم المعاملة رناسي المحتوية على سليلة. PPK سكبكس ليست متاحة تجارياً، وتنقية PPK معقدة نسبيا25،26.
يمكن أيضا تصور سليلة في ليساتيس الخلية أو مقتطفات في الهلام بولياكريلاميدي ب DAPI السلبية تلطيخ27،28،،من2930، أسلوب الذي يسمح بتقييم لطول السلسلة، ولكن هو انخفاض الإنتاجية وضعف الكمية.
ونحن الآن تقرير مقايسة سليلة سريعة وغير مكلفة، الإنتاجية المتوسطة يسمح التحديد الكمي السريع من سليلة المستويات في مختلف أنواع الجراثيم. يبدأ هذا الأسلوب بواسطة ليسينج الخلايا البكتيرية في 95 درجة مئوية في م 4 غوانيدين isothiocyanate (جتك)14 لإلغاء تنشيط phosphatases الخلوية، متبوعاً استخراج عمود غشاء والسليكا الأمثل للمعالجة السريعة لعينات متعددة. ثم يهضم الناتجة عن استخراج المحتوية على سليلة مع فائض كبير في سكبكس، مما يلغي الحاجة إلى معاملة الدناز ورناسي. نحن تشمل بروتوكول للنيكل واضحة انجذاب تطهير كميات مغ من سكبكس. وأخيراً، المستمدة من سليلة فوسفات حرة كمياً ب مقايسة اللونية البسيطة، حساسة، وتستند على حمض الأسكوربيك24 وتطبيع لمجموع البروتين الخلوي. يبسط هذا الأسلوب قياس سليلة في الخلايا البكتيرية، ونظهر استخدامه مع الممثل الأنواع من البكتيريا سلبية الغرام وإيجابية البكتيريا المتفطرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول هو موضح هنا يبسط ويسرع الكمي لمستويات سليلة في البكتيريا المتنوعة، مع مجموعة نموذجية من عينات 24 أخذ حوالي 1.5 ح الكامل عملية. هذا يسمح بالفحص السريع للعينات وتحليل لمكتبات متحولة، ويبسط الحركية تجارب قياس تراكم سليلة على مر الزمن. لقد أظهرنا أن البروتوكول يعمل بشكل فعال على ممثل…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا المشروع جامعة ألاباما في “برمنغهام قسم الأحياء المجهرية” أموال بدء التشغيل والمعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM124590 (MJG)، والمعاهد الوطنية للصحة منحة R01AI121364 (مهاجم).
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
Referencias
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate–an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
- Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
- Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
- Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate–new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
- Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
- Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
- Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
- Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
- Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
- Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
- Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
- Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
- Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
- Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
- Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
- Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
- Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
- Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
- Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
- Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
- Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
- Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
- Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
- Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
- Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
- Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
- Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
- Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
- van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
- Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
- Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
- Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
- Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
- Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).
