Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Summary

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos “tubos” e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Abstract

Artérias cerebrais e sua respectiva microcirculação entregam oxigênio e nutrientes para o cérebro através do sangue fluxo do regulamento. Células endoteliais linha o lúmen dos vasos sanguíneos e mudanças de comando no diâmetro vascular conforme necessário para atender a demanda metabólica dos neurônios. Primárias vias de sinalização endotélio-dependente de hiperpolarização do potencial de membrana (V_m) e óxido nítrico normalmente operam em paralelo para mediar a vasodilatação e, assim, aumentar o fluxo sanguíneo. Embora integral para coordenar a vasodilatação mais vários milímetros de comprimento vascular, componentes do endotélio-derivado hiperpolarização (EDH) foram historicamente difíceis de medir. Esses componentes de EDH implicar intracelular Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_eu aumenta e subsequente ativação de pequenas e intermediário condutância de Ca^{2 +}-ativado K⁺ (SK_Cacomo_Ca) canais.

Aqui, apresentamos uma ilustração simplificada do isolamento de fresco endotélio de artérias cerebrais do rato; medições simultâneas de endotelial [Ca^{2 +}]_eu e V_m usando fotometria de Fura-2 e eletrodos afiados intracelulares, respectivamente; e uma superfusion contínua de soluções salinas e agentes farmacológicos sob condições fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). Artéria cerebral posterior do círculo de Willis é removida sem a comunicação posterior e as artérias basilar. Digestão enzimática de segmentos de arteriais cerebrais posteriores limpos e posterior trituração facilita a remoção da adventícia, perivascular nervos e células musculares lisas. Resultantes posteriores cerebrais arteriais endoteliais “tubos” Então são protegidos sob um microscópio e examinaram usando uma câmera, tubo fotomultiplicador, e um ou dois Electrómetros sob contínua superfusion. Coletivamente, esse método pode medir simultaneamente alterações endoteliais [Ca^{2 +}]_eu e V_m em locais celulares discretas, além da propagação de EDH através de junções até distâncias milímetros ao longo da intacta endotélio. Este método é esperado para produzir uma análise do elevado-throughput das funções endoteliais cerebrais subjacente mecanismos de regulação de fluxo de sangue no cérebro normal e doente.

Introduction

Fluxo de sangue em todo o cérebro é regulado pela coordenação da vasodilatação entre artérias cerebrais e arteríolas em redes vasculares¹. Células endoteliais que revestem mudanças de comando de artérias de resistência cerebral vascular diâmetro conforme necessário para atender a demanda metabólica dos neurônios^1,2,3. Em particular, durante a hiperpolarização derivado de endotélio (vulgarmente conhecida por EDH), intracelular Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_eu) e sinalização eléctrica em células endoteliais vasodilatação coordenada entre as células endoteliais e seus células de músculo liso circundante através de junções para relaxamento arterial⁴. Iniciação fisiológica de EDH sequencialmente implica a estimulação do G_q-acoplados a receptores (GPCRs), um aumento de [Ca^{2 +}]_eue ativação de endotelial pequeno – e intermediário-Ca^{2 +}-ativado K⁺ (SK_Cacomo_Ca) canais para hiperpolarizar a membrana endotelial cerebral potenciais (V_m)^5,6,7. Assim, a relação íntima de endotelial [Ca^{2 +}]_eu e V_m é parte integrante do Regulamento de fluxo de sangue e indispensável para cardio e cerebrovascular função^6,8. Em toda a literatura mais ampla, numerosos estudos relataram Associação de disfunção endotelial vascular com o desenvolvimento de doenças crônicas (por exemplo, hipertensão, diabetes, insuficiência cardíaca, doença arterial coronariana, insuficiência renal crônica, doença arterial periférica)^9,10, indicando a importância de se estudar a função endotelial em condições fisiológicas, bem como patológicas.

Endotélio vascular é essencial para a produção de hiperpolarização, vasodilatação e perfusão do tecido e assim, o exame de suas propriedades celulares nativas é crucial. Como um modelo de estudo geral, preparação de modelo de tubo endotelial arterial o mouse foi publicada antes por músculo esquelético^11,12, intestino¹³, pulmão¹⁴e, recentemente, para o cérebro⁶. Estudos de simultânea [Ca^{2 +}]_eu e medições de_m V em particular têm sido publicados para o músculo esquelético endotélio arterial^15,16 , bem como de endotélio de vasos linfáticos¹⁷. Além de estudos primários, utilizando a abordagem de tubo endotelial, uma revisão abrangente das suas vantagens e desvantagens⁸ pode ser consultada para determinar se esta ferramenta experimental é apropriada para um estudo específico. Em breve, uma vantagem é que os principais componentes fisiológicos da função endothelial da pilha são retidos (por exemplo,, Ca^{2 +} influxo e liberação intracelular, hiperpolarização de V_m até o potencial de Nernst para K⁺ através SK_Cacomo ativação de_Ca e acoplamento intercelular endoteliais através de junções) sem confusão de fatores tais como a entrada do nervo perivascular, função de canais voltagem-dependentes de músculo liso e contratilidade, circulação do sangue e influências hormonais⁸. Em contraste, abordagens de cultura celular comumente usados introduzir alterações significativas na morfologia¹⁸ e íon canal expressão¹⁹ de uma maneira que grandemente pode ofuscar as comparações fisiológicas observações determinadas ex vivo ou na vivo. Limitações incluem a falta de integração com outros componentes essenciais para regular o fluxo de sangue, tais como músculo liso e flexibilidade restrita em um horário experimental, como este modelo ideal é testado dentro de 4 h de isolamento de segmento vascular intacta do animal.

Construção de um protocolo de vídeo anterior de autoria de Socha e Segal¹² e recentes desenvolvimentos experimentais no intercalar^6,15,16, por este meio demonstrar o isolamento do endotélio fresco de artéria cerebral posterior e medições simultâneas de endotelial [Ca^{2 +}]_eu e V_m usando fotometria de Fura-2 e eletrodos afiados intracelulares, respectivamente. Além disso, esta experiência implica superfusion contínua de soluções salinas e agentes farmacológicos durante condições fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). Escolhemos a artéria cerebral posterior, como rende endotélio isolado com a integridade estrutural (células acopladas através de junções) e dimensões suficientes (largura ≥ 50 µm, comprimento ≥300 µm) favoráveis para intrae sinalização intercelular ao longo e entre células endoteliais. Além disso, estudos da artéria cerebral posterior roedor estão substancialmente representados na literatura e abrangem o exame de mecanismos fundamentais de sinalização endoteliais vascular desenvolvimento/envelhecimento e patologia^{20, 21 , 22}. esta aplicação experimental é esperada para produzir uma análise de alto rendimento da função endotelial cerebral (e disfunção) e desse modo permitirá avanços significativos no entendimento do Regulamento de fluxo de sangue ao longo envelhecimento e o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.

Protocol

Antes de realizar os experimentos seguintes, certifique-se de que usar de todos os cuidados com animais e protocolos são aprovados pelos cuidados institucionais do Animal e usar Comité (IACUC) e executados de acordo com do Conselho Nacional de pesquisa “guia para o cuidado e o uso de ‘ De animais de laboratório (8th Edition, 2011) e as diretrizes de chegada. O IACUC da Loma Linda University aprovou todos os protocolos utilizados para este manuscrito para masculinos e femininos camundongos …

Representative Results

A demonstração esquemática do protocolo descrito acima é mostrada nas figuras anexadas. Um cérebro isolado de um jovem macho C57BL/6N rato adulto (5 meses) é mostrado na figura 1A. Artérias cerebrais posteriores são cuidadosamente isoladas do círculo de Willis, removido sem tecido conjuntivo e cortado em segmentos (figura 1B-D). De segmentos arteriais parcialmente digeridos, o tubo endotelial intacto é …

Discussion

À luz dos recentes desenvolvimentos^6,15,16,17, demonstraremos agora o método para isolar o endotélio arterial cerebral de rato em preparação para a medida simultânea de [Ca^{2 +}] _eu e o V_m subjacentes EDH consistentemente para ~ 2 h a 37 ° C. Embora tecnicamente difícil, podemos medir a-celular acoplamento também (veja referência⁶…

Materials

Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55