Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto
Summary
Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos “tubos” y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.
Abstract
Arterias cerebrales y su respectiva microcirculación entregan oxígeno y nutrientes a la regulación del flujo cerebral por medio de sangre. Las células endoteliales de la línea el lumen de los vasos sanguíneos y cambios de mando en el diámetro vascular según sea necesario para satisfacer la demanda metabólica de las neuronas. Principales vías de señalización de endotelial dependientes de hiperpolarización del potencial de membrana (Vm) y el óxido nítrico normalmente funcionan en paralelo para mediar vasodilatación y consiguiente aumento de flujo sanguíneo. Aunque parte integrante de la coordinación de vasodilatación sobre varios milímetros de longitud vascular, componentes de hiperpolarización derivado de endotelio (EDH) han sido históricamente difíciles de medir. Estos componentes de EDH implica intracelular Ca2 + [Ca2 +] aumenta y la posterior activación de pequeñas e intermedias conductancia de Ca2 +-activado K+ (SKCa/IKCa) canales.
Aquí, presentamos una ilustración simplificada del aislamiento de fresco endotelio de arterias cerebrales de ratón; medidas simultáneas de endotelial [Ca2 +] y Vm con Fura-2 fotometría y electrodos agudos intracelulares, respectivamente; y una superfusion continua de soluciones de sal y agentes farmacológicos bajo condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 º C). Arterias cerebrales posteriores desde el círculo de Willis se quitan de la comunicación posterior y las arterias basilares. Digestión enzimática de segmentos arteriales cerebrales posteriores limpiados y posterior trituración facilita la eliminación de la adventicia, los nervios perivasculares y las células musculares lisas. Resultantes posteriores cerebrales arteriales endoteliales “tubos” entonces están asegurados bajo un microscopio y examinaron usando una cámara, tubo fotomultiplicador, y uno o dos electrómetros bajo superfusion continua. Colectivamente, este método puede medir simultáneamente cambios endoteliales [Ca2 +] y Vm en localizaciones celulares discretos, además de separarse de la EDH a través de uniones comunicantes hasta distancias de milímetros a lo largo de la intacta endotelio. Este método se espera que un análisis de alto rendimiento de las funciones endoteliales cerebrales subyacen mecanismos de regulación de flujo de sangre en el cerebro normal y enferma.
Introduction
Flujo de sangre a través del cerebro está regulado por la coordinación de la vasodilatación cerebrales arterias y arteriolas en redes vasculares1. Células endoteliales que recubren cambios de comando resistencia cerebral arterias de diámetro vascular cuando sea necesario para satisfacer la demanda metabólica de las neuronas1,2,3. En particular, durante la hiperpolarización derivado de endotelio (conocido comúnmente como EDH), intracelular Ca2 + ([Ca2 +]) y señalización eléctrica en células endoteliales vasodilatación coordinar entre las células endoteliales y su alrededor de las células musculares lisas a través de uniones comunicantes para relajación arterial4. Iniciación fisiológica de EDH secuencialmente implica estimulación de Gq-junto a los receptores (GPCRs), un aumento de [Ca2 +]y la activación endotelial de pequeño y medio Ca2 +-activado K+ (SKCa/IKCa) canales para hyperpolarize la membrana endotelial cerebral potencial (Vm)5,6,7. Así, la íntima relación de endotelial [Ca2 +] y Vm es parte integral de regulación del flujo sanguíneo e indispensable para cardio – y cerebrovasculares función6,8. A lo largo de la literatura general, numerosos estudios han reportado la Asociación de la disfunción endotelial vascular con el desarrollo de enfermedades crónicas (p. ej., hipertensión, diabetes, insuficiencia cardíaca, enfermedad coronaria, insuficiencia renal crónica, enfermedad arterial periférica)9,10, indicando la importancia de estudiar la función endotelial en condiciones fisiológicas como patológicas.
Endotelio vascular es esencial para la producción de hiperpolarización, vasodilatación y perfusión del tejido y por lo tanto, la examinación de sus propiedades nativas de celulares es crucial. Como modelo de estudio general, preparación del modelo de tubo endotelial arterial de ratón ha sido publicado antes por músculo esquelético11,12,13de intestino, pulmón14y recientemente por el cerebro6. Estudios de simultánea [Ca2 +] y Vm medidas en particular se han publicado para músculo esquelético endotelio arterial15,16 , así como del endotelio de vasos linfáticos17. Además de los estudios primarios utilizando el enfoque de tubo endotelial, una revisión exhaustiva de sus ventajas y desventajas8 puede consultarse para determinar si esta herramienta experimental es apropiada para un estudio específico. En Resumen, una ventaja es que se conservan los componentes fisiológicos clave de la función endotelial de la célula (e.g., Ca2 + afluencia y liberación intracelular, hiperpolarización de Vm hasta el potencial de Nernst para K+ a través de /IK de SKCaCa activación y acoplamiento intercelular endotelial a través de uniones comunicantes) sin confundir factores tales como la entrada de nervios perivasculares, músculo liso canal voltaje-bloqueado función y contractilidad, circulación de la sangre y las influencias hormonales8. Por el contrario, enfoques de cultura celular utilizado introducen alteraciones significativas en la morfología18 y ion canal expresión19 de manera que puede ofuscar mucho las comparaciones con observaciones fisiológicas determinadas ex vivo o en vivo. Limitaciones incluyen la falta de integración con otros componentes esenciales para la regulación del flujo sanguíneo, como el músculo liso y flexibilidad restringida en un programa experimental, como este modelo es probado óptimamente dentro de 4 h de aislamiento de segmento vascular intacto del animal.
Construcción de un protocolo anterior vídeo por Socha y Segal12 y las últimas novedades experimentales en el provisional6,15,16, por este medio demostrar el aislamiento del endotelio fresco de las arterias cerebrales posteriores y mediciones simultáneas de endotelial [Ca2 +] y Vm con Fura-2 fotometría y electrodos agudos intracelulares, respectivamente. Además, este experimento implica superfusion continua de soluciones de sal y agentes farmacológicos durante condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 º C). Elegimos la arteria cerebral posterior, como rendimiento aislado endotelio con la integridad estructural (células juntadas a través de uniones comunicantes) y dimensiones suficientes (≥50 μm de ancho, longitud ≥300 μm) favorables para intra – e intercelular señalización a lo largo y entre células endoteliales. Además, estudios de la arteria cerebral posterior roedor substancialmente están representados en la literatura y abarcan análisis de fundamentales mecanismos de señalización endoteliales, vascular desarrollo/envejecimiento y patología20, 21 , 22. esta aplicación experimental se espera que un análisis de alto rendimiento de la función endotelial cerebral (y disfunción) y así permitirá avances significativos en la comprensión de la regulación del flujo de sangre a lo largo de envejecimiento y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A la luz de recientes desarrollos6,15,16,17demostramos ahora el método para aislar el endotelio arterial cerebral de ratón en preparación para la medición simultánea de [Ca2 +] i y V dem subyacentes EDH constantemente para ~ 2 h a 37 ° C. Aunque es técnicamente difícil, podemos medir células así de acoplamiento (véase la referencia6<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Charles Hewitt excelente asistencia técnica estableciendo equipos y suministros necesarios para los protocolos actuales. Agradecemos a los doctores Sean M. Wilson y Christopher G. Wilson, del centro de Biología Perinatal, LLU por facilitarnos un microscopio invertido adicional y un Electrómetro, respectivamente. Esta investigación ha sido apoyada por los institutos nacionales de salud beca R00-AG047198 (EJB) y nuevos fondos de puesta en marcha de Facultad Loma Linda escuela de medicina de la Universidad. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
Referencias
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