Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Summary

Questo protocollo dettaglia i passaggi, i costi e attrezzature necessarie per generare e. coli-base di estratti cellulari e implementare in vitro reazioni di sintesi di proteine entro 4 giorni o meno. Per sfruttare la natura flessibile di questa piattaforma per vaste applicazioni, discutiamo le condizioni di reazione che possono essere adattate e ottimizzate.

Abstract

Negli ultimi 50 anni, sintesi di proteina Cell-Free (CFPS) è emerso come una potente tecnologia per sfruttare la capacità trascrizionale e traslazionale delle cellule all’interno di una provetta. Eliminando la necessità di mantenere la vitalità della cellula ed eliminando la barriera cellulare, CFPS è stato fondamentale per le applicazioni emergenti in bioproduzione di proteine tradizionalmente difficili, nonché applicazioni nella prototipazione rapida per Ingegneria metabolica e genomica funzionale. I nostri metodi per l’implementazione di un e. coli-piattaforma basato su CFPS ai nuovi utenti di accedere a molte di queste applicazioni. Qui, descriviamo i metodi per preparare l’estratto attraverso l’uso di media arricchita, boccette sconcertati e un metodo riproducibile di lisi cellulare basato su sonicazione sintonizzabile. Questo estratto quindi può essere utilizzato per l’espressione della proteina in grado di produrre 900 µ g/mL o più di proteina fluorescente verde super cartella (sfGFP) in appena 5 ore dalla messa a punto sperimentale all’analisi dei dati, dato che le scorte di reattivo appropriato sono state preparate in anticipo. Il costo stimato avvio di ottenere reagenti è $4.500 che sosterrà migliaia di reazioni ad un costo stimato di $0,021 per µ g di proteina prodotta o $0,019 per µ l di reazione. Inoltre, i metodi di espressione della proteina specchio la facilità dell’installazione reazione visto nei sistemi disponibili in commercio a causa dell’ottimizzazione di reagente premiscelati, ad una frazione del costo. Al fine di consentire all’utente di sfruttare la natura flessibile della piattaforma CFPS per vaste applicazioni, abbiamo identificato una varietà di aspetti della piattaforma che possono essere ottimizzate e ottimizzato a seconda delle risorse disponibili e gli esiti di espressione della proteina desiderato.

Introduction

Sintesi di proteine senza cellula (CFPS) è emerso come una tecnologia che ha sbloccato una serie di nuove opportunità per la produzione di proteine, genomica funzionale, ingegneria metabolica e più entro gli ultimi 50 anni^1,2. Rispetto alla standard in vivo piattaforme di espressione di proteine, CFPS offre tre vantaggi principali: 1) la natura senza cellula della piattaforma consente la produzione di proteine che sarebbe potenzialmente tossici o stranieri per la cella^{3,4 ,5,6}; 2) inattivazione di DNA genomic e l’introduzione di un modello di DNA codificante il gene di interesse canale tutta l’energia sistemica all’interno della reazione per la produzione della proteina di interesse; e 3) la natura aperta della piattaforma consente all’utente di modificare e monitorare le condizioni di reazione e la composizione in tempo reale^7,8. Questo accesso diretto alla reazione supporta l’incremento dei sistemi biologici con composizioni chimiche espanse e condizioni redox per la produzione di nuove proteine e la messa a punto di processi metabolici^{2,9, 10}. diretto accesso consente inoltre all’utente di combinare la reazione CFPS con analisi di attività in un sistema singolo-pot per cicli di test per la compilazione di una progettazione più rapida¹¹. La capacità di eseguire la reazione CFPS nelle goccioline di piccolo volume o su dispositivi basati su carta maggiori azioni di alto-rendimento individuazione di supporti e prototipazione rapida^{12,13,14,15 ,16}. A seguito di questi vantaggi e la natura di plug and play del sistema, CFPS ha permesso in modo univoco una varietà di applicazioni della biotecnologia come la produzione di proteine che sono difficilmente solubile veloce in vivo^{17, 18,19,20}, rilevamento di^22,21,malattia²³, sulla domanda bioproduzione^{18,24 ,25,26,27}e formazione^28,29, i quali mostrano la flessibilità e l’utilità della piattaforma senza cellula.

Sistemi di CFPS possono essere generati da una varietà di greggio lisati da entrambe le linee cellulari procarioti ed eucarioti. Questo permette diverse opzioni nel sistema di scelta, ciascuno dei quali hanno vantaggi e svantaggi a seconda dell’applicazione di interesse. CFPS sistemi variano anche notevolmente in produttività, costi e tempi di preparazione. La maggior parte utilizzati comunemente cella estratti sono prodotti da germe di grano, dei reticolociti di coniglio, cellule di insetto e cellule di Escherichia coli , con quest’ultimo è il più redditizio per data, producendo il massimo rendimento volumetrico della proteina³⁰ . Mentre altri sistemi CFPS possono essere vantaggiosi per le loro macchine di modificazione post-traduzionale innata, emergendo applicazioni utilizzando il e. coli-base macchine sono in grado di colmare il divario generando site-specifically fosforilato e proteine glicosilate su domanda^{31,32,33,34,35}.

Le reazioni CFPS possono essere eseguite in entrambi batch, scambio continuo senza cellula (CECF) o flusso continuo senza cellula (CFCF) formati. Il formato di batch è un sistema chiuso in cui durata di reazione è limitata a causa della diminuzione quantità di reagenti e l’accumulazione dei sottoprodotti inibitori della reazione. Metodi CECF e CFCF aumentano la durata della reazione e quindi causare rendimenti volumetrici aumentata della proteina rispetto alla reazione batch. Questa operazione viene eseguita consentendo i sottoprodotti della sintesi proteica per essere rimosso dal recipiente di reazione, mentre nuovi reagenti sono forniti nel corso della reazione². Nel caso di CFCF, la proteina di interesse può essere rimosso anche dalla camera di reazione, mentre in CECF, la proteina di interesse rimane nella camera di reazione, costituito da una membrana semi-permeabile^36,37. Questi metodi sono particolarmente preziosi nel superare la scarsa resa volumetrica di difficile–express proteine di interesse^{38,39,40,41,42, 43}. Le sfide nell’attuazione degli approcci CECF e CFCF sono che 1) mentre risultano in un uso più efficiente dell’apparato bio responsabile della trascrizione e traduzione, richiedono in particolare più grandi quantità di reagenti che aumenta il costo complessivo e 2) Essi richiedono configurazioni più complesse di reazione e attrezzature specializzate rispetto al lotto formato⁴⁴. Al fine di garantire l’accessibilità per i nuovi utenti, i protocolli descritti qui messa a fuoco sul formato batch a volumi di reazione di 15 µ l con raccomandazioni specifiche per aumentare il volume di reazione per la scala di millilitro.

I metodi presentati qui abilitare non esperti con competenze di base di laboratorio (ad esempio studenti universitari) per implementare la crescita delle cellule, estrarre preparazione e installazione di reazione formato in batch per un e. coli-CFPS sistema basato. Questo approccio è conveniente rispetto ai kit disponibili in commercio senza sacrificare la facilità di installazione basato su kit di reazione. Inoltre, questo approccio consente alle applicazioni in laboratorio e in campo. Quando si decide di implementare CFPS, nuovi utenti dovrebbero valutare attentamente l’efficacia di sistemi di espressione di proteine convenzionali per investimento per l’avvio, come CFPS non può essere superiore in ogni caso. I metodi CFPS qui descritti consentono all’utente di implementare direttamente una varietà di applicazioni, tra cui la genomica funzionale, test, la produzione di proteine che sono insolubili per espressione in vivo , come pure il campo ad alta velocità applicazioni tra cui biosensori e kit didattici per biologia sintetica. Le applicazioni aggiuntive come ingegneria metabolica, ottimizzazione delle condizioni di espressione della proteina, individuazione della malattia e scalabilità utilizzando metodi CECF o CFCF sono ancora possibili ma possono richiedere l’esperienza con la piattaforma CFPS per ulteriori modifiche della reazione condizioni. I nostri metodi di combinano una crescita in media arricchita e boccette sconcertati, con metodi relativamente rapidi e riproducibili di lisi cellulare mediante sonicazione, seguita da un’installazione di reazione CFPS semplificata che utilizza ottimizzato premiscele⁴⁵. Mentre i metodi di crescita cellulare sono diventati un po’ standardizzati all’interno di questo campo, metodi per lisi cellulare variano ampiamente. Oltre a sonicazione, metodi di lisi comuni includono l’utilizzo di una pressa francese, un omogeneizzatore, battitori della perla, o lisozima e altri disagi fisici e biochimici metodi^{46,47,48, 49}. usando i nostri metodi, circa 2 mL di estratto grezzo delle cellule sono ottenute per 1 L di cellule. Questa quantità di Estratto di cellule in grado di supportare quattro cento 15 µ l CFPS reazioni, ogni produzione ~ 900 µ g/mL di proteina sfGFP reporter dal plasmide modello pJL1-sfGFP. Questo metodo costa $0,021 / µ g di prodotto sfGFP ($.019/microlitro di reazione), escluso il costo della manodopera e le attrezzature (Supplemental figura 1). A partire da zero, questo metodo può essere implementato in 4 giorni da una sola persona e ripetere le reazioni CFPS possono essere completate entro le ore (Figura 1). Inoltre, il protocollo può essere scalato in volume per grandi lotti di preparazione dei reagenti in base alle esigenze dell’utente. D’importanza, il protocollo qui presentato può essere implementato da laboratorio addestrato non-esperti quali studenti universitari, come richiede solo la capacità di laboratorio di base. Le procedure descritte di seguito e il video di accompagnamento sono stati specificamente sviluppati per migliorare l’accessibilità della piattaforma CFPS Escherichia coli per l’ampio utilizzo.

Protocol

1. Media preparazione e crescita cellulare 1 ° giorno Le cellule di e. coli BL21*(DE3) striscia da un glicerolo stock su una piastra di agar LB e incubare per almeno 18 ore a 37 ° C. Preparare 50 mL di LB media e autoclave la soluzione su un ciclo liquido per 30 min a 121 ° C. Conservare a temperatura ambiente. 2 ° giorno Preparare 750 mL di 2 x YTP media e 250 mL di soluzione di 0,4 M D-glucosio come descritt…

Representative Results

Abbiamo presentato una base di sonicazione Escherichia coli Estratto protocollo di preparazione che può essere completato in un arco di quattro giorni, con Figura 1 dimostrando la ripartizione procedurale sopra ogni giorno. C’è malleabilità ai passaggi che possono essere completati in ogni giorno con vari punti di sospensione dell’esecuzione, ma abbiamo trovato questo flusso di lavoro per essere il più efficace eseguire. Inoltre, sia il pellet ce…

Discussion

Sintesi proteica senza cellula è emerso come una tecnologia potente e abilitazione per una varietà di applicazioni che vanno dalla bioproduzione di prototipazione rapida di sistemi biochimici. L’ampiezza delle applicazioni è supportato dalla capacità di monitorare, modificare e aumentare il macchinario cellulare in tempo reale. Nonostante l’impatto di espansione di questa tecnologia di piattaforma, è rimasto ampio adattamento lento a causa di sfumature tecniche nell’implementazione dei metodi. Grazie a questo sforzo…

Materials

Luria Broth	ThermoFisher	12795027
Tryptone	Fisher Bioreagents	73049-73-7
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	1/2/8013
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P9791-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661-250G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
DTT	ThermoFisher	15508013
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
NTPs	ThermoFisher	R0481
Oxalic Acid	Sigma-Aldrich	P0963-100G
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
NH4(Glu)	MP Biomedicals	02180595.1
Mg(Glu)2	Sigma-Aldrich	49605-250G
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-5G
Putrescine	Sigma-Aldrich	D13208-25G
HEPES	ThermoFisher	11344041
Molecular Grade Water	Sigma-Aldrich	7732-18-5
L-Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500-25G
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A0884-25G
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100G
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-Histadine	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Serine	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL	Fisher Scientific	05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit	ThermoFisher	K210007
Ultrasonic Processor	QSonica	Q125-230V/50Hz	3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge	Beckman Coulter	369001
JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter	366754
1L Centrifuge Tube	Beckman Coulter	A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask	Sigma-Aldrich	Z710822
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator	Eppendorf	M1335-0000
Cytation 5	BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit	IBA	2-4998-000
pJL1-sfGFP	Addgene	69496
BL21(DE3)	New England BioLabs