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Quimica

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

このプロトコルの詳細手順、コスト、および大腸菌を生成に必要な装置・細胞抽出液をベースし、4 日間以内の in vitroタンパク質合成反応を実装します。広範なアプリケーションは、このプラットフォームの柔軟な性質を活用するには、と最適化することができます反応条件について検討します。

Abstract

最後の 50 年にわたって無細胞タンパク質合成 (当たり) は、試験管内のセルの転写と翻訳の能力を活用する強力な技術として浮上しています。迅速なプロトタイプで当たりを伝統的に挑戦的な蛋白質の製造の新興アプリケーションとしてアプリケーションを基礎されているセルの実行可能性を維持する必要があるし、細胞の障壁を排除することによって、代謝工学、ゲノム機能学。私たちの方法、エシェリヒア属大腸菌の実装-ベース CFPS プラットフォームは、これらのアプリケーションの多くにアクセスする新しいユーザーを許可します。ここでは、我々 は豊かなメディア、困惑してフラスコおよび可変超音波ベースのセル換散の再現可能なメソッドを使用して抽出を準備する方法を説明します。この抽出物は適切な試薬株式を事前に準備されていることを考える 900 μ g/mL 以上のデータ分析、実験のセットアップからちょうど 5 時間でスーパー フォルダー緑色蛍光蛋白質 (sfGFP) を作り出すことができる蛋白質の表現を使用できます。試薬を得る推定のスタートアップのコストは $4,500 を何千もの $0.021 産生される蛋白の μ g あたりの $0.019 μ L 反応のあたりの推定コストで反応を維持します。さらに、蛋白質の表現方法は、コストのほんの一部で、試薬中古ミックスの最適化のための市販のシステムに見られる反応セットアップの容易さをミラーします。CFPS 広範なアプリケーション用の柔軟な性質を活用するユーザーを有効にするためにさまざまな調整し、使用可能なリソースおよび蛋白質の表現の結果に応じて最適化できるプラットフォームの側面を位置付けています。望まれています。

Introduction

無細胞タンパク質合成 (当たり) は、タンパク質の生産、機能ゲノム学、代謝工学と最後の 50 年間1,2以内に詳細のための新しい機会の数をアンロックしている技術として浮上しています。株当たり標準生体内タンパク質式プラットフォームと比較して、3 つの利点を提供します: 1) 携帯無料自然のプラットフォームの潜在的毒性や細胞の3,4 外国語になるタンパク質の製造を可能に ,5,6;2) ゲノム DNA の不活性化および興味の遺伝子を符号化する DNA テンプレートの導入が関心のタンパク質の生産への反応の中で全身のエネルギーのすべてをチャネルします。・ 3) プラットフォームのオープンな性質により、ユーザーが変更したり、反応条件とリアルタイム7,8の組成を監視します。この反応への直接アクセスをサポートしている拡張化学や新規タンパク質の生産と代謝過程2,9,のチューニングのための酸化還元状態の生物学的システムの増強10. 直接のアクセスは、ユーザーがより迅速な設計、ビルド、テスト サイクル11のシングル ポット システムで活性測定法と当たりの反応を組み合わせることもできます。紙ベースのデバイスのさらなるサポート ハイスループット探索努力とラピッドプロトタイピング12,13,14,15 または少量の水滴で当たり反応を実行する能力 ,16。これらの利点は、システムのプラグ アンド プレイの性質の結果として当たりが一意に溶けてエクスプレス体内しにくいタンパク質の生産などのバイオ テクノロジーのアプリケーションのさまざまなを有効に17、 18,19,20, 疾患21,22,23, 需要製造18,24 の検出、25,26,27、および教育28,29、柔軟性と携帯無料プラットフォームのユーティリティを表示します。

CFPS システムは様々 な原核生物と真核生物の細胞から粗野な lysates から生成できます。これにより、対象のアプリケーションによって一長一短があるそれぞれの選択のシステムで多様なオプション。CFPS システムは準備時間、コスト、および生産性にも大きく異なります。最も一般的エキス、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞、大腸菌細胞、後者はタンパク質30 の最高の容積の生産に最も費用対効果されてから生成されるセルを活用.他の当たりのシステムはその生得的な翻訳後修飾機械に有利であるが、新興の大腸菌を使用してアプリケーション-ベース機械が生成 site-specifically リン酸化によってギャップを埋めることができると需要31,32,33,34,35の糖蛋白質。

株当たりの反応は、いずれかのバッチ、連続交換携帯無料 (展) または連続的なフロー セル無料 (CFCF) 形式で実行できます。バッチ形式は、その反応の有効期間は反応物と反応の抑制の副産物の蓄積の減少量により制限クローズド システムです。展と CFCF 方法、反応の寿命を延ばすし、それによってバッチ反応と比較して増加した体積蛋白質収量の結果します。これは、新しい反応の反応2コース全体で供給している反応容器から削除するタンパク質合成の副産物を許可するで。CFCF の場合は、反応室、展、半透膜36,37から成る反応室のままに興味の蛋白質の中から興味の蛋白質を削除できます。これらのメソッドは特に関心38,39,40,41,42、エクスプレス難しいタンパク質の低体積収率を克服するための貴重です 43。展と CFCF アプローチの実装の課題は、1) 一方、彼らは転写と翻訳を担当バイオ機械のより効率的な使用の結果、特に大きい増加の全体的なコストと 2 試薬量が必要)複雑な反応セットアップとバッチ形式44と比較して特殊な装置が必要です。新しいユーザーのためのアクセシビリティを確保するためにプロトコルに記載フォーカス ミリリットル スケールの反作用ボリュームを増加させるための特定の推奨事項 15 μ L の反応ボリュームでバッチ形式で。

記載方法は、細胞増殖を実装、エキスの準備、および、エシェリヒア属大腸菌の形式反応セットアップをバッチ (学生) など基本的な実験技術と非専門家を有効にする-ベースの当たりシステム。この方法は、反応のキット ベース セットアップの容易さを損なうことがなく市販のキットと比較して費用対効果です。さらに、このアプローチにより、アプリケーション実験室およびフィールド。当たりを実装するかを決める、新しいユーザーする必要があります当たりはすべてのケースで優れてはないかもしれないスタートアップ投資の従来の蛋白質の表現システムの有効性を評価徹底的に。ここで説明 CFPS 方法機能ゲノミクス、高スループット テスト、フィールドと同様に、体内式の扱いやすいタンパク質の生産を含む、アプリケーションのさまざまなを直接実装するユーザーを有効にします。バイオ センサー、合成生物学の教育キットを含むアプリケーション。代謝工学などの追加アプリケーション チューニングのタンパク質式条件、病気の検出、およびスケール アップを使用して展または CFCF メソッドはまだ可能ですが、さらに反応の編集 CFPS プラットフォームとの経験があります条件。我々 の方法は、超音波処理、次に最適化されたプレミックス45を利用して簡易 CFPS 反応セットアップを介してセル換散の比較的迅速かつ再現性のある方法と成長リッチなメディアと困惑してフラスコを組み合わせます。細胞の増殖方法はややこのフィールド内で標準化になるが、セル換散方法が異なります。一般的な換散方法のほか超音波、フレンチ プレス、ホモジナイザー、ビーズ ビーターやリゾチーム、他生化学的および物理的な中断方法46,47,48,の利用49。 私たちのメソッドを使用すると、セルの 1 L あたり原油細胞抽出液の約 2 mL が得られます。細胞抽出液のこの量は 400 をサポートできる 15 μ L 当たり反応、各生産 〜 900 μ g/mL テンプレート プラスミドの pJL1 sfGFP から記者 sfGFP 蛋白質の。この方法で費用 $0.021/μ g sfGFP 生産 ($.019/μ L 反応)、労働および機器 (補足図 1) のコストを除きます。スクラッチから始めて、このメソッドは、一人で 4 日間で実装することができ、CFPS 反応時間 (図 1) 以内に完了することができますを繰り返します。さらに、ユーザーのニーズに合わせて試薬調製の大きなバッチ量プロトコルを拡張できます。重要なは、それだけ基本的な実験技術を必要とは、ここで提示されたプロトコルを訓練所の非専門家、学生などによって実装できます。以下に説明する手順とそれに伴うビデオは、特に広範な使用のためのエシェリヒア属大腸菌株当たりプラットフォームのアクセシビリティを改善するために開発されています。

Protocol

1. メディアの準備と細胞増殖 日 1 グリセロールから連勝大腸菌BL21*(DE3) 細胞 LB 寒天培地プレート ストックし、37 ° C で少なくとも 18 時間インキュベート 121 ° C で 30 分の液体のサイクルで LB 媒体のオートクレーブ ソリューション 50 mL を準備します。常温で保存します。 日 2 補足情報の説明に従って 0.4 M D-グ?…

Representative Results

超音波処理による大腸菌にエキスを提案した各曜日に手続き型の内訳を示す図 1の 4 日間にわたって、完了できる準備のプロトコル。毎日様々 な一時停止ポイントで完了ことができます手順に展性があるが、このワークフローを実行する最も効果的であることがわかった。さらに、細胞ペレット (ステップ 1.3.18) と完全に準備された抽出 (…

Discussion

無細胞タンパク質合成は、様々 な生化学システムのラピッドプロトタイピング製造に至るアプリケーションに強力な有効にする技術として浮上しています。広範なアプリケーションは、監視、操作、およびリアルタイムでの細胞機械装置を強化する能力によってサポートされます。このプラットフォーム技術の拡大の影響から、広範な適応は推移しているメソッドの実装の技術的なニュアン…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、博士ジェニファー VanderKelen、アンドレア ・ Laubscher とテクニカル サポートのトニー Turretto、ウェズリー ・花王、Layne ウィリアムズ役に立つ議論のためのクリストファー ・高さを確認したいと思います。著者も認める法案とリンダ霜基金、バイオ テクノロジーの創造活動助成プログラム (RSCA 2017) Scholarly、シェブロン バイオ テクノロジー応用研究基金助成、Cal Poly 研究応用センター資金・国立科学財団 (NSF-1708919)。MZL は、カリフォルニア州立大学大学院助成を認めています。MCJ は、陸軍研究所 W911NF-16-1-0372 を認めている、全米科学財団助成金 MCB 1413563 と MCB 1716766、空軍研究所優秀グラント FA8650 センター-15-2-5518、防衛脅威削減局許可ダビデとルシール パッカード財団、カミーユ ドレイファス先生学者プログラム部門のエネルギー BER グラント デ-SC0018249、人間のフロンティア科学プログラム (RGP0015/2017 年)、エネルギー省の共同ゲノム研究所 ETOP グラント HDTRA1-15-10052/P00001 とサポートのためシカゴのコミュニティ信頼でサール資金からのサポートとシカゴ医療コンソーシアム。

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
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Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
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