Die Galleria Mellonella Waxworm Infektionsmodell für verbreitet Candidiasis

Summary

Galleria Mellonella dient als ein Wirbellosen Modell für disseminierter Candidiasis. Hier beschreiben wir die Infektion Protokoll und unterstützende Daten für das Modell Wirksamkeit.

Abstract

Candida -Spezies sind häufige Pilzinfektionen Kommensalen des Menschen besiedeln, Magen-Darm-Trakt, Haut und Schleimhaut-Oberflächen. Unter bestimmten Bedingungen kann Candida überwuchern ihre natürliche Nischen wodurch schwächenden Schleimhaut Infektionen als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen, sind ein wichtiger Schwerpunkt der Untersuchung wegen der damit verbundenen hohen Sterblichkeitsraten. Tiermodelle der disseminierten Infektion gibt es für Fortschreiten der Krankheit zu studieren und die Merkmale der Candida Pathogenität seziert. Von diesen bietet die Galleria Mellonella Waxworm Infektionsmodell ein kostengünstige experimentelles Werkzeug für Hochdurchsatz-Untersuchungen der systemischen Virulenz. Vielen anderen bakteriellen und Eukaryoten Krankheitserregern sind effektiv in G. Mellonella , Pathogenität, verstehen untersucht worden, so dass es eine weithin akzeptierte Modellsystem. Jedoch kann Variation in der Methode verwendet, um G. Mellonella infizieren verändern phänotypischen Ergebnisse und Interpretation der Ergebnisse erschweren. Hier beschreiben wir die vor- und Nachteile des Modells Waxworm zu studieren systemischen Candida -Pathogenese und detail einen Ansatz zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit. Unsere Ergebnisse markieren Sie den Bereich der Sterblichkeit Kinetik in G. Mellonella und beschreiben Sie die Variablen, die diese Kinetik modulieren können. Schließlich steht diese Methode als eine ethische, schnelle und kostengünstige Ansatz zur Virulenz in einem Modell von disseminierter Candidiasis zu studieren.

Introduction

Candida -Spezies sind gemeinsame menschliche Kommensalen, die in der Lage als opportunistische Krankheitserreger in Schwellenländern sind stark immungeschwächten und Dysbiotic Patienten. Obwohl viele Candida -Spezies Krankheit verursachen können, ist C. Albicans die am weitesten verbreitete Ursache von disseminierter Candidose^1,2. Systemische Erkrankung ergibt sich aus C. Albicans Zugriff auf den Blutkreislauf durch entweder direkte Penetration der bisher restriktiven Host Barrieren oder Einführung in chirurgischen Websites und andere Verstöße gegen die Körper-³. Candida -Spezies nutzen eine Reihe von pathogenen Prozessen, systemische Erkrankung innerhalb des Hosts, einschließlich Filamentierung, Biofilmbildung Immunzelle ausweichen und entkommen und Eisen⁴Aufräumvorgang zu verursachen. In-vitro- Methoden existieren um individuelle pathogenen Mechanismen zu untersuchen, aber Tiermodellen weiterhin die beste Option, um die Gesamtheit der Krankheit Ergebnis^5,6untersuchen. Die bisherige Forschung hat viele Instanzen der vielversprechenden in-vitro- Untersuchungen der Virulenz zu reproduzieren in Vivo^7,8detaillierte. So, Tiermodelle sind erforderlich, um die Virulenz zu bewerten in-vivo. Die meisten Krankheitsmodelle setzen auf Mäuse, als Surrogat für Infektionen beim Menschen trotz C. Albicans Unfähigkeit, natürlich murinen Systeme besiedeln als Kommensalen⁹dienen. Wirbellosen Modelle von disseminierter Candidiasis gehören der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans, die Frucht zu fliegen, Drosophila Melanogasterund Waxworm Galleria Mellonella, obwohl Bedenken über grundsätzliche Unterschiede in grundlegende Physiologie haben Host Körpertemperaturen und Expositionswege ihre breite Akzeptanz^10,11. behindert

Vor kurzem wurde die G. Mellonella Waxworm Infektionsmodell, Modell Pathogenität einer Vielzahl von bakteriellen und pilzlichen Krankheitserregern^12,13,14übernommen. Vorteile dieses Modells sind die relativ geringen Kosten, erhöhter Durchsatz, Benutzerfreundlichkeit und ethische Bedenken bezüglich tierischen Wohltätigkeit gegenüber murinen Modellen reduziert. Für Forscher bedeutet dies höhere Fähigkeit, mehrere Variablen, stärkere Konfidenzintervalle, schnellere experimentieren und Umgehung des tierischen Protokolle zu testen. G. Mellonella diente als Plattform, um schnell beurteilen, C. Albicans Virulenz nach Störung der Gene, die erforderlich für Biofilm-Bildung, Filamentierung und gen-Verordnung über klinische Isolate^{11,15 ,16}. Jüngste Studien haben Untersuchung antimykotische Wirksamkeit mit G. Mellonella bewerten die Pharmakokinetik von Drogetätigkeit und Widerstand unter in-Vivo -Einstellungen, die sonst schwierig und zeitaufwendig ^{sind integriert 17,18}. Jedoch haben Studien von C. Albicans Virulenz in G. Mellonella kompliziert durch angeblich hohe Variation innerhalb Experimente und inkonsistente Protokolle zwischen Forschungsgruppen, die unterschiedliche Virulenz Phänotypen erzeugen zwischen Mäusen und Waxworms^{11,13,19,20,21}. Hier beschreiben wir eine G. Mellonella Protokoll zur Standardisierung von C. Albicans Infektionen, Erhöhung der Reproduzierbarkeit in Virulenz Experimente, und Übereinstimmung mit den zuvor beschriebenen Studien der Virulenz in Murine zu demonstrieren Modelle.

Frühere Studien gezeigt, dass die Paarung Typ-wie (MTL) Locus auf Chromosom 5 C. Albicans Zelle Identität und Kompetenz ähnlich Saccharomyces Cerevisiae und andere Ascomycete Pilze²²Paarung regelt. Die Mehrheit der C. Albicans Isolate sind heterozygot MTL Locus, Codierung eines jeden der MTLein und MTLα Allele(MTL/α), und sind folglich steril^{15, 23 , 24}. Verlust eines MTL Allele durch Verlust der Heterozygotie (LOH) oder Mutation führt zu homozygoten MTLein oder MTL-α-Stämme, die einen phänotypischen Wechsel von der sterilen “weiße” Zustand zu unterziehen, können die Paarung zuständigen “undurchsichtig” Staat²⁵. Bisherigen Arbeit hat hervorgehoben, dass Verlust der Heterozygotie MTL Virulenz in murinen Modellen einer systemischen Infektion über anderen Stamm Hintergründe²⁶reduziert. Hier zeigen wir das G. Mellonella Modell für disseminierter Candidose mit genetisch ähnliche experimentelle können Sie den Beitrag der MTL Heterozygotie, Virulenz in G. Mellonelladarzustellen. Wir zeigen, dass MTL Konfiguration beeinflusst C. Albicans Pathogenität, wo MTLα Stämme waren weniger virulenten sowohl in Bezug auf MTL/α MTLein Zellen, ähnlich wie Erkenntnisse in murinen Infektion Modell²⁶.

Protocol

Alle beschriebene Methoden setzen auf Einsatz von Wirbellosen Gastgeber und bedürfen keiner Zustimmung der institutionellen Animal Care und verwenden Committee (IACUC). 1. Galleria Mellonella Waxworm Larven Bestellen Sie Larven von Großhändlern und Lieferanten, die nicht einzuführen, Hormone, Antibiotika oder andere Behandlungen für die Larven und die sind in der Lage zu versenden und liefern lebende Exemplare. Achten Sie darauf, alle Larven vom gleichen Liefera…

Representative Results

Hier zeigen wir eine reproduzierbare Methode für die Verwendung von G. Mellonella Waxworms ein disseminierter Candidiasis Modell einer Infektion mit C. Albicansuntersuchen. Die fachgerechte Lagerung, Wartung und Auswahl der Larven für eine Infektion sind wesentlicher Bestandteil der Versicherung Reproduzierbarkeit G. Mellonella Sterblichkeit (Abb. 1A). Gesunde Larven, die aktiv sind, haben eine helle Farbe gelb/ta…

Discussion

G. Mellonella Waxworm Modell steht als ein wirksames Instrument für die schnelle und reproduzierbare Analyse von C. Albicans Virulenz. Dieses ausführliche Protokoll stützt sich auf konsistente Bereitstellung einer definierten infektiöse Dosis an der gleichen Stelle über einen Stapel von Larven. Infektiöse Dosis hat tiefgreifende Auswirkungen auf die G. Mellonella Mortalität während der Verwendung von Larven zwischen ihren ersten Ankunft und zehn Tagen nach Erhalt zu ähnlichen Ergebniss…

Materials

Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O