Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, nichtmenschlichen Primaten CD34 isolieren+ Zellen aus grundiert Knochenmark, um diese Zellen mit Lentivirale Vektoren gen zu modifizieren und ein Produkt zur Infusion in die autologe Host vorzubereiten. Die Gesamt-Protokoll-Länge ist ca. 48 h.
Abstract
Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HSPC) Stammzelltransplantation wurde ein Grundstein zur Therapie Leukämie und anderen Krebsarten seit fast einem halben Jahrhundert, das einzige bekannte Heilmittel des humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) Infektion zugrunde liegt, und zeigt große Versprechen in die Behandlung von Erbkrankheiten wie Beta-Thalassämie. Unsere Gruppe entwickelte ein Protokoll zum Modell HSPC Gentherapie bei nichtmenschlichen Primaten (NHP), so dass Wissenschaftler zur Optimierung vieler der gleichen Reagenzien und Techniken, die in der Klinik angewendet werden. Hier beschreiben wir Methoden zur Reinigung von CD34+ HSPCs und langfristig anhaltenden hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Teilmengen aus grundiert Knochenmark (BM). Identische Techniken können für die Reinigung von anderen HSPC-Quellen (z. B. mobilisiertem peripherem Blutstammzellen [PBSCs]) eingesetzt werden. Dargestellt ist ein 2-Tages-Protokoll in der Zellen werden gereinigt, kultiviert, geändert mit Lentivirus (LV) und Infusionslösung zurück in die autologe Host vorbereitet. Wichtige Messwerte des Erfolgs sind die Reinheit der CD34+ HSPC Bevölkerung, die Fähigkeit der gereinigten HSPCs morphologisch unterschiedliche Kolonien in halbfesten Medien und vor allem Gen Modifikation Effizienz zu bilden. Der entscheidende Vorteil HSPC Gentherapie ist die Fähigkeit, eine Quelle der langlebigen Zellen, die alle blutbildenden Zelltypen hervorbringen. Als solche wurden diese Methoden zu Modell Therapien gegen Krebs, genetische Erkrankungen und Infektionskrankheiten eingesetzt. In jedem Fall wird die therapeutische Wirksamkeit von verbessern die Funktion der unterschiedlichen HSPC nachkommen, einschließlich der roten Blutkörperchen, T-Zellen, B-Zellen und/oder myeloische Teilmengen gegründet. Die Methoden zu isolieren, zu ändern, und bereiten HSPC Produkte sind direkt anwendbar und übersetzbar für mehrere Krankheiten bei menschlichen Patienten.
Introduction
Gen der Stammzelltherapie ist ein mächtiges Mittel, um ein breites Spektrum der Erkrankungen des Menschen. HSPC Gentherapie ist ein besonders attraktiver Ansatz, durch (i) die relative Leichtigkeit des Sammelns dieser Zellen von Patienten, (Ii) die Fülle des Wissens, die verfügbar ist, in Bezug auf Zelle Oberfläche Phänotypen und ex-Vivo-Kultur-Parameter, und, wie das Feld erweitert, denn Iii) Es stellt Wissenschaftler mit einer immer größer werdenden Toolbox Gen Modifikation Strategien abgestimmt auf verschiedene Krankheiten von Interesse. Wir sind aktiv HSPC gen Therapieansätze aus verschiedenen Blickwinkeln, darunter die grundlegende Wissenschaft der Biologie, das Engraftment gen veränderten HSPCs im vorklinischen in-vivo-Modelle und die Anwendung relevanten Patientenpopulationen HSPC untersucht. Wir und andere haben die Zelle Oberfläche Phänotyp der funktionell unterschiedliche HSPC Teilmengen1,2,3, die Mobilisierung und Klimaanlage-Regimen, die HSPC Ertrag und Engraftment bei gleichzeitiger Minimierung der maximieren gekennzeichnet Toxizität4,5, und das Gen Modifikation und gen-Bearbeitung-Strategien, die auf eine Vielzahl von bösartigen, genetische und Infektionskrankheiten6,7,8, zugeschnitten 9,10. Die Funktion und Engraftment gen veränderten HSPCs können in einer Reihe von kleinen und großen Tier-Modelle, darunter Mäuse, Hunde und NHP ausgewertet werden. NHP-Modelle sind insbesondere vorteilhaft, weil viele Reagenzien, z. B. Antikörper spezifisch für HSPC Zelle Oberflächenproteine wie CD34 und CD90, in Menschen- und NHP Zellen austauschbar verwendet werden. Außerdem gibt es im Gegensatz zu Mäusen, große Tiere wie NHP eine größere Annäherung der Skala der gentechnische Veränderung für klinische Wirksamkeit notwendig. Zu guter Letzt NHP sind der Goldstandard für die Modellierung von menschlichen Krankheiten wie HIV-1 Infektion11 und einer aufstrebenden Modellsystem für Kandidaten gegen Krebs und Anti-HIV-Immuntherapien12,13.
Der Zweck dieses Protokolls ist, Methoden zur Reinigung, genetisch verändern und Vorbereitung NHP HSPC Infusion Produkte zu skizzieren. Obwohl nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls haben wir bereits gezeigt, dass diese Produkte in autologen NHP Gastgeber weiterhin, Anlass zu allen hämatopoetischen Linien und therapeutische Wirksamkeit bei den unterschiedlichsten Krankheiten Modelle1 bieten. Wir haben auch charakterisiert die Infektionsstaus anwachsen HSPCs und bauten eine Plattform zur Verfolgung der Kinetik, Menschenhandel und Phänotyp der einzelnen HSPCs und deren Nachkommen, folgende autologe Transplantation1,14. Die hier vorgestellten Methoden wurden mit den folgenden Zielen entwickelt: (i) zum Isolieren von hochreinen HSPCs und langfristige anwachsen HSC Teilmengen, Ii) primitive HSCs während ex-Vivo-Kultur zu pflegen, und Iii) effizient gen ändern-entweder lose HSPCs oder langfristige anwachsen HSC Teilmengen. Wir beschäftigen magnetische unterstützt-Zellsortierung (MACS), sowie Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS), um phänotypisch/funktionell unterschiedliche HSPC Populationen, konsistent mit den Methoden der vielen Gruppen2,15, isolieren 16. Die Aufrechterhaltung der primitiven HSCs in Kultur (d. h. die Differenzierung der Zellen in engagierten Stammväter, die Anlass zu voll zu minimieren differenziert lymphatischen und myeloische Teilmengen) ist eine wesentliche Facette des hier beschriebenen Protokolls. Obwohl wir zuvor Ansätze gekennzeichnet haben, um HSPCs zu erweitern, unter Beibehaltung einer primitiven Phänotyp17,18, hier beschreiben wir eine Protokoll, die konzentriert sich auf die Erhaltung der HSCs über eine minimale (48 h) und ex-Vivo-Kultur definiert.
Die effiziente Modifikation von HSPCs und HSC Teilmengen ist ein zentrales Ziel dieses Protokolls. Unter mehreren Ansätzen haben wir berichtet, zwei sind bei weitem die am meisten untersuchten in klinischen Studien: LV-vermittelten gentechnische Veränderung und Nuklease-vermittelten gen Bearbeitung1,6,19. Gen-Bearbeitung Strategien verwenden Sie eine der Nuklease-Plattformen, um insbesondere eine gezielte gen von Interesse zu ändern, z. B. C-C-Chemokin-Rezeptor Typ 5 (CCR5) für die Behandlung der HIV-Infektion7,19 oder Bcl11A für die Behandlung Hämoglobinopathien6. Hier konzentrieren wir uns auf LV-vermittelten gentechnische Veränderung, in denen transgene Ladungen Genom1,8,20semirandomly integrieren. Ein wesentlicher Vorteil von LV Ansätze ist die Fähigkeit, große Mengen von genetischem Material (bis zu 8 oder 9 Kilobases) liefern. Obwohl gen Bearbeitung Strategien entwickelt werden, um gezielt ein Transgen von Interesse, nur auf einen bestimmten Ort zu integrieren durch Spender homologe Rekombination (HDR), erfordern diese Methoden weiter Entwicklung in-vitro- und in kleiner Tiermodelle. Im Gegensatz dazu wurden LV Vektoren ausgiebig in NHP und Patienten21,22eingesetzt. Wichtig ist, kann das Protokoll hier beschrieben wird, welche Nutzung BM als Ausgangspunkt HSPC Quelle grundiert, leicht und im großen und ganzen, z. B. angepasst werden um PBSCs zu isolieren. Wie oben beschrieben, nutzen wir die hohe genetische Ähnlichkeit zwischen Menschen und NHP Reagenzien zu verwenden, die auf beide Arten anwendbar sind. Schließlich wurde dieser Ansatz angepasst, um anderen blutbildenden Teilmengen, nämlich T Zellen12,23,24zu ändern; das Aufkommen der wirksame Ansätze der T-Zell-Immuntherapie hat stark auf die gleiche LV-Plattform genutzt, die in diesem Protokoll verlassen. Diese Methoden eignen sich für jeden Forscher HSPC Biologie oder LV-vermittelten gentechnische Veränderung interessiert. Zum Beispiel das HSPC Reinigung Protokoll hier vorgestellten Roman HSC-angereicherten Teilmengen zu charakterisieren genutzt werden wie zuvor beschrieben,1,15,25. Ebenso werden die LV-Transduktion, die hier vorgestellte Methoden in ähnlicher Weise könnte angewendet und für zahlreiche andere Zelltypen und experimentelle Fragen, sowohl im in-vitro und in vivo Modellen weiterentwickelt.
Zusammenfassend lässt sich sagen stellen wir Ihnen Methoden zum isolieren und NHP HSPCs genetisch zu verändern. Diese Methoden können für andere Arten und anderen Quellen der HSPCs leicht angepasst werden. Dieses sorgfältig geprüfte Protokoll zeigt viel versprechend in der Modellierung von wirksamen Therapien für zahlreiche Krankheiten des Menschen.
Protocol
Representative Results
Discussion
LV-Vektor Engineering ist die am besten charakterisierten Methode zum gen ändern-Zelltypen wie CD34+ HSPCs, für die anschließende Transplantation in-vivo. Das hier beschriebene Protokoll soll maximiert die Anzahl der gen-modifizierte HSPCs, die langfristig in Vivo beibehalten und bieten klinischen Vorteile für Patienten mit verschiedenen malignen, infektiöse und genetischen Krankheiten. Obwohl gen Bearbeitung Strategien im letzten Jahrzehnt entstanden, LV-modifizierten Zellen sind die besten studierte in …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Helen Crawford für die Vorbereitung dieses Manuskript, Jim Woolace für Grafik-Design, und Veronica Nelson und Devikha Chandrasekaran für die Teilnahme an der Entwicklung des Protokolls. Die Entwicklung dieses Protokolls wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem NIH National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (R01 AI135953 und AI138329, H.P.K.) und der National Heart, Lung and Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 und U19 HL129902, H.P.K.), sowie NIH P51 OD010425 und teilweise durch das NIH/NCI Cancer Center, Support Grant P30 CA015704. H.P.K. ist ein Markey molekulare Medizin Ermittler und unterstützt als erste Empfänger der José Carreras/E. Donnall Thomas Stiftungslehrstuhl für Krebsforschung und Fred Hutch-Stiftungsprofessur für Zellen und Gene Therapy.
Materials
| Stemspam SFEM II ("HSPC") Media | StemCell | 09655 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650-100 | |
| 100% Ethanol | Decon labs | M18027161M | |
| Cyclosporine | Sigma | 30024-25MG | |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | PS-0500-A | |
| CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) | TaKaRA | T100B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100g | |
| HEPES | Sigma | H9897 | |
| Rat anti-mouse IgM magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | |
| Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | |
| Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) | Peprotech | 300-19 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P-4505 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Colony Gel 1402 | ReachBio | 1402 | |
| QuadroMACS Separators | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS L25 Columns | Miltenyi biotec | 130-042-401 | |
| 10 mM PGE2 | Cayman Chemical | 14753-5mg | |
| TC-treated T-75 flasks | Bioexpress | T-3001-2 | |
| Non-TC-treated T-75 flasks | Thermo-Fisher | 13680-57 | |
| 20 ml syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| 16.5 G needles | BD Precision | 305198 | |
| Syringe Tip Cap | BD Biosciences | 305819 | |
| QuickExtract DNA Solution | Epicentre | QE09050 | |
| 8-tube strip cap PCR Tubes | USA scientific | 1402-2708 | |
| 96-well Thermocycler | Thermo-Fisher | 4375786 | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS | fisher scientific | 352350 | |
| Ultracomp ebeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 3 mL Luer-Lock Syringes | Thermo-Fisher | 14823435 | |
| 35 mm x 10 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 60 mm x 15 mm cell culture dish | Corning | 430196 | |
| 150 mm x 25 mm cell culture dish | Corning | 430599 | |
| Non TC treated flasks | Falcon | 353133 | |
| Qiagen DNA extraction | Qiagen | 51104 | |
| PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 | Biolegend | 328110 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 | BD horizon | 562449 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 | BD Pharmingen | 561212 | |
| V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 | BD Biosciences | 561291 | |
| Autologous Serum | Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Virus-Conditioned Media (VCM) | Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 | Kiem Lab | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
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