Opname van nieuwe lipide-gecoate nanodeeltjes met Falcarindiol door menselijke mesenchymale stamcellen
Summary
Dit artikel beschrijft de inkapseling van falcarindiol in lipide-gecoate 74 nm nanodeeltjes. De mobiele opname van de nanodeeltjes door menselijke stamcellen in lipide druppels wordt gecontroleerd door fluorescerende en confocal beeldvorming. Nanodeeltjes worden vervaardigd door de snelle injectie methode van oplosmiddel verschuiven, en hun grootte wordt gemeten met de Dynamische lichtverstrooiing techniek.
Abstract
Nanodeeltjes zijn de focus van een toegenomen belangstelling voor drug delivery systemen voor kankertherapie. Lipide-gecoate nanodeeltjes zijn geïnspireerd van grootte en structuur van low-density lipoproteins (LDLs) omdat kankercellen een verhoogde behoefte aan cholesterol hebben te verspreiden, en dit heeft benut als een mechanisme voor het leveren van geneesmiddelen aan kanker cellen. Bovendien, afhankelijk van de drug chemie, inkapselen van de drug kan nuttig zijn om te voorkomen dat de afbraak van de drug tijdens het verkeer in vivo. Daarom in dit onderzoek dit ontwerp wordt gebruikt om fabriceren van lipide-gecoate nanodeeltjes van de antikanker drug falcarindiol, biedt een potentiële nieuwe levering systeem van falcarindiol om te stabiliseren van de chemische structuur tegen afbraak en verbeteren de opname door tumoren. Falcarindiol nanodeeltjes, werden met een fosfolipide en cholesterol enkelgelaagde encapsulating het gezuiverde drug-kern van het deeltje, ontworpen. Het lipide enkelgelaagde kleefmiddel bestaat uit 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol) en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) samen met de TL Label DiI (molaire ratio’s van 43:50:5:2). De nanodeeltjes worden vervaardigd gebruikend de snelle injectie-methode, die een snelle en eenvoudige techniek is te precipiteren nanodeeltjes door goed-solvent voor anti-oplosmiddel uitwisseling. Het bestaat uit een snelle injectie van een ethanol-oplossing met de nanoparticle-onderdelen in een waterige fase. De grootte van de fluorescerende nanodeeltjes is gemeten met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS) op 74.1 ± 6.7 nm. De verbreiding van de nanodeeltjes is getest in menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) en beeld met behulp van fluorescentie en confocale microscopie. De opname van de nanodeeltjes wordt waargenomen in hMSCs, suggereert het potentieel voor een dergelijk stabiel drug delivery systeem voor falcarindiol.
Introduction
Lipide-gecoate nanodeeltjes zien een verhoogde belangstelling voor met betrekking tot hun functie als medicijn afgiftesystemen voor kanker therapie1. Kankers hebben een gewijzigde lipide-metabole herprogrammering2 en een toegenomen behoefte aan cholesterol3vermenigvuldigen. Ze overexpress LDLs1 en neem in meer LDLs dan normale cellen, in de mate dat een kankerpatiënt LDL graaf zelfs4 dalen kan. LDL opname bevordert agressief fenotypen5 resulterend in proliferatie en invasie in borst kanker6. Een overvloed aan LDL-receptoren (LDLRs) is een voorspellende indicator voor gemetastaseerde potentieel7. Geïnspireerd door de LDL en haar ICT door kankercellen, een nieuwe strategie heeft geroepen: maken van de drug van de kanker voedsel eruit8. Dus, deze nieuwe nanoparticle drug levering ontwerpen als een mechanisme voor het leveren van geneesmiddelen zijn geïnspireerd door het kern – en lipide-gestabiliseerde ontwerp van de natuurlijke LDLs11 8,9,10 tot kankercellen. Deze passieve targeting levering systeem ondersteunt het inkapselen van, met name, de hydrofobe drugs, die worden meestal gegeven in mondelinge doseringsvorm maar bieden slechts een kleine hoeveelheid van de drugs naar de bloedbaan, dus het beperken van hun verwachte werkzaamheid12. Zoals met de stealth liposomen13, een coating van polyethyleenglycol (PEG) draagt bij aan vermindering van een immunologische reactie en het verkeer in de bloedbaan voor optimale tumor opname door de vermeende breidt versterkte permeatie en retentie (EPR) effect 14 , 15. in aanvulling op, in sommige gevallen, de instabiliteit in de omloop en ongewenste distributie in het systeem16, sommige obstakels blijven echter onopgelost, zoals hoe en in welke mate dergelijke nanodeeltjes worden genomen in door cellen en wat is hun intracellulaire lot. Het is hier dat dit document de opname van de nanoparticle van een bepaald hydrofobe anticancer geneesmiddel falcarindiol behandelt, met behulp van de confocal en epifluorescence beeldvormende technieken.
Het doel van de studie is te fabriceren van lipide-gecoate nanodeeltjes van falcarindiol en te bestuderen van hun intracellulaire penetratie in hMSCs. Aldus, potentieel te stabiliseren zijn administratie, het overwinnen van de uitdagingen in verband met de levering, en verbetering van de biologische beschikbaarheid. Dus de beoordeling van een nieuw systeem van de levering voor deze antikanker drug. Eerder, falcarindiol heeft al bestuurd mondeling via een hoge concentratie gezuiverd falcarindiol als een food supplement17. Er is echter behoefte aan een meer gestructureerde benadering leveren deze veelbelovende drug. Daarom, falcarindiol nanodeeltjes, met een fosfolipide en cholesterol encapsulating enkelgelaagde met de gezuiverde drug vormen de kern van het deeltje, werden ontworpen. De methode van de snelle injectie van oplosmiddel verschuiven, zoals onlangs ontwikkeld door Needham et al. 8, wordt in deze studie gebruikt om in te kapselen de polyacetyleen falcarindiol.
De methode is eerder gebruikt voor de fabrikatie van lipide nanodeeltjes kapselen diagnostische beeldvorming agenten18,19, evenals het testen van moleculen (triolein)27 en drugs (orlistat, niclosamide stearate)8 2827, ,. Het is een relatief eenvoudige techniek wanneer uitgevoerd met de juiste moleculen. Nanosized deeltjes, op de grens van hun kritische nucleatie (~ 20 nm diameter), vormt van zeer slecht oplosbaar hydrofobe opgeloste stoffen opgelost in een polair oplosmiddel. De oplosmiddelen uitwisseling wordt bereikt door een snelle injectie van de organische oplossing in een overmaat aan antisolvent (meestal een waterige fase in een 1:9-organische: waterige volumeverhouding)20,21.
De compositorische ontwerp van de nanodeeltjes meerdere voordelen meebrengen. De DSPC:Chol componenten bieden een zeer strakke, bijna ondoordringbare, biocompatibel en biologisch afbreekbaar enkelgelaagde. De PEG biedt een sterically stabiliserende interface die fungeert als een schild van opsonization door het immuunsysteem, vertragen van elke opname door de reticuloendotheliaal systeem (lever en milt) en bescherming tegen de mononucleaire fagocytensysteem systeem, voorkomen van hun retentie en aantasting van het immuunsysteem, en vandaar, het verhogen van hun verkeer halftijds in bloed22. Hierdoor kunnen de deeltjes te laten circuleren totdat ze op zieke sites extravasate, zoals tumoren, waar het vaatstelsel lekkende is, waardoor EPR-effect aanleiding geeft tot passieve accumulatie van de deeltjes. Bovendien, de lipide vacht maakt het mogelijk een betere controle hebben over de nanodeeltjes grootte door kinetisch overvulling de kern op haar kritieke nucleus dimensie27,28. Lipiden veroorzaken verschillende oppervlakte-eigenschappen (met inbegrip van peptide richt, die nog niet beschikbaar voor dit project was) een zuivere drug kern en een lage polydispersiteit22,27,28. De methode die wordt gebruikt voor de korrelgrootte is DLS, een techniek waarmee onderzoekers voor het meten van de grootte van een groot aantal deeltjes op hetzelfde moment. Deze methode kan echter de metingen aan grotere maten, bias, als de nanodeeltjes niet monodispersed23. Dit probleem wordt beoordeeld met het lipide vacht zo goed. Meer details van deze fundamentele ontwerpen en de kwantificering van alle kenmerken die worden gegeven in andere publicaties27,28.
De drug ingekapseld in de nanodeeltjes is falcarindiol, een dieet polyacetyleen gevonden in planten uit de familie van de Apiaceae. Het is een secundaire metaboliet van de alifatische C17polyacetylenen type dat is gevonden om de gezondheidsbevorderende effecten, met inbegrip van cytotoxiciteit tegen een breed scala van kanker cellijnen, anti-inflammatoire activiteit en antibacteriële effecten weer te geven. De hoge reactiviteit is gerelateerd aan haar vermogen om te communiceren met verschillende biomoleculen, als een zeer reactieve alkylerend gemachtigde tegen mercapto en amino groepen24. Falcarindiol heeft eerder is aangetoond dat het verminderen van het aantal neoplastische laesies in de dikke darm17,25, hoewel de biologische mechanismen nog onbekend zijn. Het is echter de gedachte dat het samenwerkt met biomoleculen zoals NF-recombination, COX1, COX-2 en cytokines, remming van hun tumor progressie en cel proliferatie processen, leidt tot de arrestatie van de celcyclus, endoplasmatisch reticulum (ER) benadrukken, en apoptose 17,,26 in kankercellen. Falcarindiol wordt gebruikt in deze studie een voorbeeld anticancer geneesmiddel vanwege de antikanker potentieel en het mechanisme worden momenteel bestudeerd, en omdat blijkt veelbelovend antikanker effecten. De mobiele opname van de nanodeeltjes is getest in hMSCs en beeld met behulp van epifluorescence en confocale microscopie. Dit celtype werd gekozen vanwege zijn grote omvang, waardoor ze ideaal zijn voor microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een gedetailleerd protocol voor het fabriceren van lipide-gecoate nanodeeltjes voor drug delivery met de eenvoudige, snelle, reproduceerbare en schaalbare snelle injectie methode van het oplosmiddel verschuiven was gevolgd27,28 en wordt gepresenteerd in dit document, als toegepast op falcarindiol. Door het beheersen van de snelheid van de injectie van de organische fase in de waterfase en met behulp van coating lipiden bij adequate concentraties jas de falcarindi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Moustapha Kassem (Odense University Hospital, Denemarken) voor de menselijke mesenchymale stamcellen. De auteurs bedanken de Deense medisch Bioimaging centrum voor toegang tot hun microscopen. De auteurs bedanken de Carlsberg en Villum grondslagen voor financiële steun (E.A.C.). De auteurs erkennen de financiële steun van de Niels Bohr hoogleraarschap award van de Deense nationale Research Foundation.
Materials
| 12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) | Microlab Aarhus A/S | ML 33154LP | |
| 6 well plates | Greiner Bio One International GmbH | 657160 | |
| Absolute Ethanol | EMD Millipore (VWR) | EM8.18760.1000 | |
| Chloroform | Rathburn Chemicals Ltd. | RH1009 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | |
| Confocal Microscope | Zeiss LSM510 | ||
| Cover Slips thickness #1.5 | Paul Marienfeld GmbH & Co | 117650 | |
| Desiccator | Self-build | ||
| DiI | Invitrogen | D282 | |
| DLS | Beckman Coulter | DelsaMAXpro 3167-DMP | |
| DSPC (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850365C | |
| DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 880120C | |
| eVol XR | SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. | 2910200 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| Fluorescence Miccroscope | Olymous IX81 | With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD | |
| Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Magnetic flea | VWR Chemicals | 15 x 4.5 mm | Cylindrical shape with PTFE coating |
| Magnetic stirrer | IKA | RT-10 | |
| Minimum Essential Media | Gibco | 32561-029 | |
| PBS tablets for cell culture | VWR Chemicals | 97062-732 | |
| Pen/strep | VWR Chemicals | 97063-708 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) | Thermo Fisher | 10010031 | |
| Rotary Evaporator | Rotavapor, Büchi Labortechnik AG | R-210 | |
| Sample concentrator | Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC | SBHCONC/1 |
Referencias
- Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).
- Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5 (1), 189 (2016).
- Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14 (3), 228 (2017).
- Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33 (5), 449-452 (2016).
- Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).
- dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13 (16), (2014).
- Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36 (46), 6462-6471 (2017).
- Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: “put the drug in the cancer’s food”. Journal of Drug Targeting. 24 (9), 836-856 (2016).
- Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. , (2009).
- Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124 (3), 163-171 (2007).
- Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45 (5), 954-966 (2004).
- Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13 (8), 0202709 (2018).
- Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1068 (2), 133-141 (1991).
- Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41 (1), 189-207 (2001).
- Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10 (5), 0123461 (2015).
- Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9 (2), (2016).
- Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
- Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
- Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. , (2018).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -. P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25 (4), 1970-1979 (2009).
- Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).
- Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69 (1), 1-9 (2018).
- Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41 (3), 683-693 (2016).
- Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
- Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
- Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). , (2018).
- Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. , (2017).
