Inibição do crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de Lablab purpureus L.
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica. Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.
Abstract
Contaminação por aflatoxinas em culturas alimentares e alimentos para animais é um grande desafio em todo o mundo. As aflatoxinas, produzidas pelo fungo Aspergillus flavus (a. flavus) são potentes agentes cancerígenos que reduzem substancialmente o valor das culturas de milho e outras culturas de óleo rico como amendoim além de posar uma ameaça grave para a saúde humana e animal. Diferentes abordagens, incluindo tradicionais de reprodução, expressão transgênica da resistência associada a proteínas e RNA de interferência (RNAi)-com base induzida pelo anfitrião silenciamento de crítica a. flavus alvos de gene, estão sendo avaliados para aumentar resistência de aflatoxina em culturas sensíveis. Após estudos têm mostrado um importante papel de α-amilase em produção de patogênese e aflatoxina a. flavus , sugerindo que este gene/enzima é um alvo potencial para reduzir o crescimento da . flavus e produção de aflatoxina. A este respeito, o atual estudo foi realizado para avaliar uma expressão heteróloga (sob controle do promotor constitutivo CaMV 35S ) de uma proteína de como inibidor de α-amilase Lablab purpureus L. (AILP) no milho contra a. flavus. AILP é uma proteína de 36-kDa, que é um inibidor competitivo da enzima α-amilase da . flavus e pertence à família de proteína lectina – arcelin – α-amilase inibidor em comum feijão. Estudos in vitro, antes do trabalho atual tinham demonstrado o papel de AILP na inibição da atividade de α-amilase da . flavus e crescimento fúngico. Crescimento de fungos e produção de aflatoxina em grãos maduros foram monitorados em tempo real usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus . Este kernel triagem ensaio (KSA) é muito simples de configurar e fornece dados confiáveis e reprodutíveis na infecção e a extensão da propagação que pode ser quantificada para avaliação de germoplasma e linhas transgénicas. A fluorescência da estirpe GFP é estreitamente correlacionados com fungal crescimento e, por extensão, é bem correlacionado aos valores de aflatoxina. O objetivo do trabalho atual foi implementar esse conhecimento anterior em uma colheita comercialmente importante como milho para aumentar a resistência de aflatoxina. Nossos resultados mostraram uma redução de 35% e 72% no crescimento da . flavus em sementes de milho transgênicos AILP-expressando que, por sua vez, traduzida em uma redução de 62% e 88% nos níveis de aflatoxina.
Introduction
Contaminação por micotoxinas pelos gêneros de fungos, Aspergillus, Fusarium, Penicilliume Alternaria é um grande problema de alimentos e alimentação de culturas cultivadas em todo o mundo1,2,3. Entre estes fungos fitopatogênicos, Aspergillus tem o maior impacto adverso na saúde humana e animal e o valor de colheita. Aspergillus flavus (A. flavus) é um patógeno oportunista planta que infecta rico oleaginosas tais como o milho, caroço de algodão e de amendoim e produz os potentes carcinógenos, aflatoxinas, bem como numerosos metabólitos secundários tóxicos (SMs). Milho é um alimento importante e alimenta das culturas cultivadas em todo o mundo e é altamente suscetível à contaminação pela . flavus. O impacto econômico da contaminação por aflatoxinas em perde e valor reduzido no milho pode ser tanto quanto $ 686,6 milhões/ano no EUA2 com previstas alterações no clima global, o impacto de aflatoxinas pode resultar em maiores perdas económicas no milho com estimativas tão elevadas quanto $ 1,68 bilhões/ano no futuro próximo2. Tendo em conta os efeitos adversos econômicos e saúde de aflatoxinas em humanos e animais, controle pré-colheita aflatoxina no milho pode ser a maneira mais eficiente para prevenir a contaminação por aflatoxinas em alimentos e produtos de alimentação.
A abordagem de controle pré-colheita principal para a resistência de aflatoxina em milho que tem sido amplamente utilizado nas últimas décadas é principalmente por meio de reprodução, que requer uma quantidade significativa de tempo4. Recentemente, a biocontrol teve algum sucesso na redução de aflatoxina em grande escala campo aplicações5,6. Além de biocontrole, aplicação de ferramentas moleculares de ponta como ‘Host induzidas pelo silenciamento de genes’ (HIGS) através de RNAi e transgênico expressão de proteínas associadas a resistência tem tido algum sucesso na redução do crescimento da . flavus e a aflatoxina produção em estudos de laboratório e de campo de pequena escala. Essas abordagens são atualmente sendo otimizadas além de identificar novos alvos potenciais do gene a. flavus para manipulação futura.
Além de genes que estão diretamente envolvidos na produção de micotoxinas como alvos de estratégias de controle de transgênicos, amilases de fungosas têm sido mostradas para desempenhar um papel crítico na manutenção de uma produção bem sucedida de patogênese e micotoxinas durante as fases iniciais de infecção de planta do anfitrião. Alguns exemplos incluem Pythium pleroticum (agente causal da podridão do rizoma de gengibre), Fusarium solani (agente causal da murcha de couve-flor), onde a correlação positiva entre a expressão de patogenicidade e α-amilase e atividade foram observadas 7,8. Inibição da atividade de α-amilase através de gene nocaute ou abordagens “knockdown” afeta negativamente a produção de crescimento e toxina fúngica. Um mutante de nocaute de α-amilase da . flavus foi incapaz de produzir aflatoxinas quando cultivadas em amido substrato ou degermed grãos de milho9. Da mesma forma, em Fusarium verticillioides uma estirpe de nocaute de α-amilase não conseguiu produzir fumonisina B1 (micotoxinas) durante a infecção de sementes de milho,10. Em um estudo mais recente, Gilbert et al. (2018) demonstraram que uma baseada em RNAi derrubar de expressão de α-amilase a. flavus através de HIGS reduziu significativamente a. flavus produção crescimento e aflatoxina durante a infecção de milho do kernel11 .
Inibidores específicos da atividade de α-amilase também produziram resultados semelhantes como obtido para baixo-regulação da expressão de α-amilase. O primeiro relatório sobre o papel de um inibidor de α-Amilase fúngica resistência veio o isolamento e caracterização de um inibidor de tripsina-α-amilase 14-kDa de linhagens de milho resistentes à . flavus12. Rastreio suplementar de várias centenas de espécies de plantas por Fakhoury e Woloshuk levado à identificação de uma proteína de como inibidor de α-amilase 36-kDa (AILP) das sementes de feijão de hyacinth, Lablab purpureus L.13. A sequência do peptídeo de lectinas AILP se assemelhava, pertencente à família de inibidor de lectina – arcelin – α-amilase em comum relatado feijão14,15. AILP purificado não apresentam qualquer atividade inibitória para mamíferos tripsina e mais in-vitro caracterização mostraram inibição significativa do crescimento da . flavus e germinação conidiais13. Os relatórios apresentados aqui claramente, shows de α-amilase pode servir como um alvo em abordagens de controle para restringir patógenos ou pragas que dependem de mobilização do amido (através da atividade de α-amilase) e aquisição de açúcares solúveis, como fonte de energia durante a sua patogénica interação com as plantas hospedeiras.
Alfa-amilase é conhecido por ser crítico na . flavus patogenicidade9,10,11e dada a importância do AILP como um potente antia. flavus agente (inibição/antigrowth α-amilase)13, geramos plantas de milho transgênicas expressando Lablab AILP gene sob o promotor constitutivo de CaMV 35S. O objetivo foi investigar se a expressão heteróloga deste inibidor de α-amilase no milho é eficaz contra a produção da . flavus patogênese e aflatoxina durante a infecção de milho do kernel. Nossos resultados demonstram que sementes de milho transgênicos expressando AILP significativamente reduziram a. flavus produção crescimento e aflatoxina durante a infecção do kernel.
Protocol
Representative Results
Discussion
As perdas de rendimento em culturas agrícolas devido a pragas e patógenos é um problema global de20. Atualmente, a aplicação de fungicidas sintéticas e pesticidas é o predominante para controlar patógenos vegetais e pragas, mas toxicidade residual destes compostos bioquímicos na alimentação humana e animal pode representar uma ameaça grave para a saúde humana e animal21. Considerando a importância econômica do milho como comida e cultura alimentar, redução …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a David Meints, Universidade de Arkansas por sua assistência no desenvolvimento e analisando o milho transgénico durante as primeiras gerações. Este trabalho recebeu o apoio financeiro do projeto CRIS USDA-ARS 6054-42000-025-00D. Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica em recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura. Política de oportunidade de emprego igual (EEO) dos USDA-ARS mandatos de igualdade de oportunidades para todas as pessoas e proíbe a discriminação em todos os aspectos das operações, práticas e políticas de pessoal da agência.
Materials
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
Referencias
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