Подготовка Гушукан (GSK) Гранулы для In Vivo и In Vitro Эксперименты
Summary
В этой статье содержится подробный протокол для подготовки рабочего решения гранул Гущукана для исследований на животных и гранул ГСК, содержащих сыворотку для экспериментов in vitro. Этот протокол может быть применен к фармакологическим исследованиям травяных лекарств, а также рецепты как для in vivo, так и для экспериментов in vitro.
Abstract
Традиционная китайская травяная медицина играет роль альтернативного метода в лечении многих заболеваний, таких как постменопаузальный остеопороз (POP). Gushukang (GSK) гранулы, на рынке рецепт в Китае, имеют кости защитные эффекты в лечении Pop. Перед введением в организм, одна стандартная процедура подготовки обычно требуется, которая направлена на содействие освобождению активных компонентов из сырых трав и повышения фармакологических эффектов, а также терапевтических результатов. Это исследование предлагает подробный протокол для использования GSK гранулы в in vivo и in vitro экспериментальных анализов. Сначала авторы предоставляют подробный протокол для расчета соответствующих животным доз гранул для исследования in vivo: взвешивания, растворения, хранения и администрирования. Во-вторых, в этой статье описаны протоколы микро-КТ сканирования и измерения параметров костей. Была проведена оценка подготовки образцов, протоколов работы микроКТ-машины и количественной оценки параметров костей. В-третьих, готовятся гранулы ГСК, содержащие сыворотку, а наркосодержащая сыворотка добываема для экстракорпорированного остеокластогенеза и остеобластогенеза. Гранулы ГСК вводили два раза в день крысам в течение трех дней подряд. Затем кровь собирали, центрифугировали, инактивировали и отфильтровывали. Наконец, сыворотка была разбавлена и используется для выполнения остеокластогенеза и остеобластогенеза. Описанный здесь протокол можно считать эталоном фармакологических исследований фитотравных рецептурных препаратов, таких как гранулы.
Introduction
Традиционная китайская медицина (ТКМ) является одним из важных дополнительных и альтернативных подходов к лечению остеопороза1,2. Отвар воды является основной и наиболеечасто используемой формой формулы 3. Однако есть и недостатки: плохой вкус, неудобства для перевозки, короткий срок годности и непоследовательные протоколы, ограничивающие использование, а также лечебные эффекты. Чтобы избежать вышеуказанных недостатков, а также проводить лучшие эффекты, гранулы были разработаны и широко используются4. Хотя многие исследования исследовали фармакологические механизмы одного или более эффективных компонентов из гранул5,6,7, точные механизмы и основные фармакологические процессы по-прежнему трудно определить. Это потому, что слишком много эффективных компонентов из одного гранулы могут одновременно оказывать аналогичные или противоположные эффекты4. Таким образом, разработка одного стандартного протокола для подготовки гранул перед доставкой в организм не только будет иметь большое влияние на терапевтические результаты, но также требуется как для in vivo и in vitro анализы.
Кроме того, лечебные эффекты гранул в клинике трудно подтвердить и точно определить с помощью in vitro или ex vivo исследований, что создает проблему, потому что фармакологические механизмы являются слишком сложными. Для решения этой проблемы, препарат-содержащей сыворотки был впервые предложен Ташино в 1980-х8. С тех пор, многочисленные исследователи применяются препарат-содержащей сыворотки для фитотерапии, в том числе гранулы9,10,11. В настоящее время выбор сыворотки, содержащей наркотики, для исследования in vitro рассматривается как одна из стратегий, которая тесно имитирует физиологические условия.
Гранулы Гушуканга (ГСК) были разработаны для лечения постменопаузального остеопороза (POP) на основе клинической практики в свете теории ТКМ. Гранулы GSK предотвращают потерю костной массы у озвиэктомизированных (OVX) мышей in vivo, подавляют остеокластическую резорбцию костей и стимулируют остеобластическое формирование костей4. Следовательно, Li et al.12 обнаружили, что гранулы GSK обладают костными защитными эффектами у мышей OVX, повышая активность рецепторов кальция для стимуляции формирования костей. Для подтверждения костно-защитного эффекта, а также фармакологических эффектов гранул ГСК авторы здесь предоставляют детальную процедуру подготовки рабочих растворов и препарата (GSK granule)-содержащей сыворотки. Кроме того, в этой статье описывается применение гранул ГСК в модели остеопоротической мыши OVX и Гранул-содержащей GSK сыворотке для экстракорпорированного остеокластогенеза/остеобластогенеза.
Гранулы GSK состоят из нескольких трав13,14 и могут быть полностью растворены в сольном легко. Таким образом, солин служит в качестве транспортного средства. Шам-управляемых мышей (Шам) и OVX мышей вводили такой же объем сольника, как гранулы управляемых мышей. Эквивалентные дозы гранул ГСК для мыши были рассчитаны на основе уравнения Meeh-Rubner15. Это уравнение не только имеет преимущество получения безопасных дозах, но и гарантирует фармакологические эффекты15. Три дозы гранул ГСК были созданы следующим образом: (1) GSKL: OVX – низкодозированные гранулы ГСК, 2 г/кг/день. (2) GSKM: OVX – среднедозные гранулы ГСК, 4 г/кг/день. (3) ГСКХ: OVX – высокодозные гранулы ГСК, 8 г/кг/день. Мыши в группах GSKL, GSKM и GSKH интрагастрически вводили гранулы ГСК. Карбонат кальция (600 мг/таблетка) с витамином D3 (125 международных единиц/таблетка), например, в зрелом и продаваемый продукт (например, кальтрат «CAL» для лечения и профилактики остеопороза, был использован в качестве положительного контроля.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гранулы агентов ТКМ стали одним из распространенных вариантов для формулировок или рецептов. Гранулы GSK состоят из нескольких травяных лекарств, основанных на клиническом опыте или теории ТКМ, и они оказывают лучшие лечебные эффекты с меньшим количеством побочных эффектов4</s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 и 81330085), программой инновационной команды, Министерством науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программе для инновационной команды, Министерство науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программе для инновационной команды, Министерство науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программе для инновационной команды, Министерство науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программе для инновационной команды, Министерство науки и технологий Китая (2015RA4002 к WYJ), программа для Инновационная команда, Министерство образования Китая (IRT1270 в WYJ), Шанхайский медицинский центр хронических заболеваний TCM (2017-01010 до WYJ), Три года действий по ускорению разработки плана традиционной китайской медицины (2018-2020)-CCCX-3003 в WYJ), и национальные ключевые проекты в области научно-исследовательских разработок (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
Referencias
- Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
- Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
- Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
- Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
- Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
- Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
- Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
- Tashino, S. “Serum pharmacology” and “serum pharmaceutical chemistry”: from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
- Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
- Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
- Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
- Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
- Zhang, Y. P. . Pharmacology Experiment. , (1996).
- Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors’ expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
- Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
- Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).
