Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen
Summary
We beschrijven een in vivo immunisatie, translationeel hepatitismodel in BALB / c-muizen dat kan worden gebruikt om de pathogenese van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te bestuderen, inclusief geslachtsverschillen die bij deze ziekte worden waargenomen. We zullen beschrijven hoe dit model reproduceerbare analyses demonstreert met behulp van in vivo en in vitro experimentele technieken.
Abstract
Geneesmiddel-geïnduceerde auto-immune hepatitis (DIH) is het meest voorkomende hepatische geneesmiddel-geïnduceerde overgevoeligheidsproces waargenomen bij ongeveer 9 tot 12% van de patiënten met auto-immune hepatitis. De overgrote meerderheid van de patiënten met DIH zijn vrouwen. De onderliggende mechanismen van deze sekseverschillen in prevalentie zijn onduidelijk vanwege het gebrek aan diermodellen die menselijke ziekten nabootsen. Toch wordt algemeen aangenomen dat onderliggende mechanismen geassocieerd zijn met menselijke leukocytenantige haplotypen en geslachtshormonen. Daarentegen hebben we met behulp van een DIH-muismodel ontdekt dat IL-4 cd4 + T-cellen heeft geïnitieerd die gericht zijn tegen een epitoop van cytochroom P450 2E1 induceert instroom van neutrofielen, macrofagen en mestcellen in de levers van vrouwelijke BALB / c-muizen. Met behulp van dit model hebben we ook aangetoond dat IL-33-geïnduceerde FoxP3 + regulerende T-cellen bescherming bieden tegen DIH bij vrouwelijke en mannelijke muizen. Dit DIH-model wordt geïnduceerd door muizen te immuniseren met een epitoop van CYP2E1 dat covalent is veranderd met een medicijnmetaboliet die is geassocieerd met DIH. Deze epitoop wordt herkend door patiënten met DIH. Onze methode induceert robuuste en reproduceerbare hepatitis en auto-antilichamen die kunnen worden gebruikt om de pathogenese van DIH te bestuderen. Hoewel in vivo studies onnodige pijn en angst bij muizen kunnen veroorzaken wanneer ze onjuist worden uitgevoerd, is het voordeel van een in vivo model het vermogen om de pathogenese van ziekte bij een groot aantal muizen te evalueren. Bovendien kunnen biologische effecten van de veranderde levereiwitten worden bestudeerd met behulp van invasieve procedures. De toevoeging van in vitro studies aan het experimentele ontwerp maakt snelle herhaling en mechanistische analyse op cellulair niveau mogelijk. Zo zullen we ons modelprotocol demonstreren en hoe het kan worden gebruikt om in vivo en in vitro mechanismen van DIH te bestuderen.
Introduction
Het doel van deze methode is om een muismodel van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te beschrijven dat zich in vivo ontwikkelt en aan te tonen hoe het kan worden gebruikt om de moleculaire, immunologische en genetische basis van deze ziekte te onderzoeken. Het langetermijndoel van onze studies is om mechanismen te ontdekken die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van chronische leverontsteking en -letsel door DIH bij gevoelige patiënten te bestuderen. Leverziekte en cirrose vormen de zesde meest voorkomende doodsoorzaak bij volwassenen tussen de 25 en 64 jaar. Idiosyncratische DILI, soms aangeduid als geneesmiddel-geïnduceerde auto-immune hepatitis (DIH) is de derde meest voorkomende oorzaak van acuut leverfalen in de Verenigde Staten. DIH is het meest voorkomende door levergeneesmiddelen geïnduceerde overgevoeligheidsproces dat wordt waargenomen bij ongeveer 9 tot 12% van de patiënten met auto-immune hepatitis1. De overgrote meerderheid van de patiënten met DIH zijn vrouwen 2,3,4. Een type DIH ontwikkelt zich bij gevoelige personen na toediening van gehalogeneerde vluchtige anesthetica zoals isofluraan, sevofluraan, desfluraan of halothaan. Deze anesthetica binden covalent aan levereiwitten met reactieve producten van hun metabolisme, waardoor nieuwe autoantigenen worden gecreëerd die allergische of auto-immuunreacties kunnen veroorzaken5.
De studie van pathogene mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van anestheticum en elke vorm van DIH is eerder belemmerd door het ontbreken van een diermodel dat de inductie van menselijke ziekten nauw nabootst. We hebben een experimenteel muizenmodel van DIH ontwikkeld met kenmerken die lijken op immuungemedieerde DILI bij patiënten. Hepatitis wordt geïnduceerd door immunisatie met een van de twee autoantigenen die covalent zijn gemodificeerd door de trifluoroacetylchloride (TFA) metaboliet die wordt gevormd na oxidatief metabolisme van het anestheticum door het enzym cytochroom P450 2E1 (CYP2E1)5. Eén autoantigeen is de hepatische cytosolische S100-leverfractie, een mengsel van verschillende eiwitten6, en het tweede autoantigeen is een epitoop van CYP2E1 dat wordt herkend door sera van patiënten met anesthetisch immuungemedieerd DILI7. Door BALB/c-muizen te gebruiken, die relatief resistent zijn tegen experimentele auto-immune hepatitis, onderscheiden we ons model van het S100-geïnduceerde immunisatiemodel van auto-immune hepatitis bij C57Bl/6J-muizen8.
Vanwege de diverse klinische presentaties is DIH moeilijk te bestuderen bij patiënten. Translationele experimentele modellen bieden de mogelijkheid om de pathogenese van ziekte in vivo en in vitro te evalueren. Op dit moment zijn er geen andere alternatieve methoden voor het induceren van DIH die in vivo of in vitro adaptieve of aangeboren immuunresponsen volledig onderzoeken zonder het gebruik van dieren. Bovendien, aangezien trifluoroacetylering van S-100 of het CYP2E1-epitoop geen irriterend immunogeen lijkt te produceren, en we DIH induceren door immunisatie met TFA-veranderde eiwitten, zullen deze dieren geen ether, gehalogeneerde verdoving, barbituraat of alcohol ontvangen voorafgaand aan immunisatie of andere procedures, aangezien deze middelen de parameters die we bestuderen kunnen veranderen. Toch hebben we ons muisgebruik verminderd door computersimulatie te gebruiken om de bindingsvoorkeuren van ons ontdekte CYP2E1-epitoop9 te bevestigen en hebben we menselijke DIH gespiegeld die vrouwelijk geslacht impliceert door aan te tonen dat vrouwelijke BALB / c-muizen een ernstiger DIH10 ontwikkelen.
Ondanks diverse presentaties van DIH bij patiënten en uitdagingen in de studie van klinische ziekten, is posttranslationele modificatie van inheemse eiwitten door reactieve geneesmiddelmetabolieten een geaccepteerd sleutelmechanisme in de pathogenese DIH die volgt op gehalogeneerde anesthetica11. Onderzoekers accepteren ook dat CYP2E1 een belangrijk autoantigeen is in dit proces 12,13. De rol van interleukine (IL)-4-upregulated CD4+T-cellen die een posttranslationeel gemodificeerd CYP2E1 en andere levereiwitten herkennen, is een geaccepteerde initiator van anesthetisch DIH door neutrofielen, eosinofielen en mestcellen in de lever aan te trekken14, en dit mechanisme is bevestigd in vele vormen van DIH15,16. Geïnduceerde FoxP3-expresserende CD4+CD25+T-cellen (Tregs) verminderen de ernst van DIH, en relatieve tekortkomingen van deze cellen in de milt verergeren DIH 10,7. De meeste vooruitgang in het begrijpen van DIH is dus mogelijk gemaakt door gebruik te maken van in vivo muismodellen om de genetische, metabole en immunologische mechanismen van DIH zowel in vivo als in vitro te evalueren.
Omdat wij en andere onderzoekers rollen hebben ontdekt voor IL-4, neutrofielen en eosinofielen bij het initiëren van DIH met behulp van verschillende muismodellen, geloven we dat deze observatie onze bewering ondersteunt dat ongeacht het gebruikte DIH-model, hepatitis en letsel worden geïnduceerd door IL-4. De kracht van ons protocol ligt in het gebruik van in vivo methodologie, zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, en herhaling van histologie, CD4 + T-celproliferatietests en cytokines. De kracht van ons gebruik van in vitro studies is dat ze het aantal muizen verminderen dat nodig is, terwijl ze de methodologie bieden om cellulaire interacties te isoleren die DIH aansturen. We raden het gebruik van mannelijke en vrouwelijke muizen aan omdat dit de kans op onbewuste vooroordelen bij de interpretatie van resultaten vermindert en het vertaalpotentieel van onze studies versterkt, omdat de incidentie, prevalentie en ernst van DIH hoger is bij vrouwen17. We raden aan dat muizen worden verkregen van één leverancier; als dit echter niet mogelijk is, verkrijg dan nestgenootcontroles of wildtypemuizen van dezelfde leverancier als de genetisch veranderde muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kracht van dit protocol ligt in de reproduceerbaarheid; het is dus van cruciaal belang om zich aan de voorgestelde stappen te houden. Formulering van het immunogeen kan voor sommigen een barrière zijn; we hebben ons model echter gereproduceerd met behulp van het epitoop dat in ons document wordt beschreven, waardoor de noodzaak om de S100-fractie van de lever te isoleren, wordt weggenomen. Het is waarschijnlijk dat extra epitopen of eiwitten kunnen worden veranderd en hepatitis kunnen induceren na immunisaties; we be…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Njoku wil graag Dr. Noel R. Rose, MD PhD, bedanken voor zijn begeleiding en inzichtelijke discussies die hebben geresulteerd in de formulering van dit model.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
Referencias
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
