In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln
Summary
Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.
Abstract
Der Modellorganismus C. elegans bietet ein ausgezeichnetes System zur Durchführung von In-vivo-Calcium-Bildgebung. Sein transparenter Körper und seine genetische Manipulierbarkeit ermöglichen die gezielte Expression genetisch kodierter Kalziumsensoren. Dieses Protokoll skizziert den Einsatz dieser Sensoren für die In-vivo-Bildgebung der Kalziumdynamik in Zielzellen, insbesondere der Körperwandmuskulatur der Würmer. Durch die Verwendung der Ko-Expression von präsynaptischem Kanalrhodopsin kann die Stimulation der Acetylcholin-Freisetzung aus exzitatorischen motorischen Neuronen mit blauen Lichtimpulsen induziert werden, was zu einer Muskeldepolarisation und reproduzierbaren Veränderungen des zytoplasmatischen Kalziums führt. Ebenen. Zwei Schneckenimmobilisierungstechniken werden mit unterschiedlichen Schwierigkeitsgraden besprochen. Der Vergleich dieser Techniken zeigt, dass beide Ansätze die Physiologie der neuromuskulären Kreuzung erhalten und die reproduzierbare Quantifizierung von Kalziumtransienten ermöglichen. Durch die Kombination von Optogenetik und funktioneller Kalziumbildgebung können Veränderungen der postsynaptischen Kalziumhandhabung und Homöostase in einer Vielzahl mutierter Hintergründe bewertet werden. Die vorgestellten Daten validieren sowohl Immobilisierungstechniken als auch untersucht speziell die Rolle des C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase und des calciumaktivierten BK Kaliumkanals in der Körperwandmuskel-Calciumregulation.
Introduction
Dieses Papier stellt Methoden zur In-vivo-Calcium-Bildgebung von C. elegans Körperwandmuskeln mit optogenetischer neuronaler Stimulation vor. Die Kombination eines muskelexprimierten genetisch kodierten Kalziumindikators (GECI) mit blauem Licht löste eine neuronale Depolarisation aus und bietet ein System, um die evozierten postsynaptischen Calciumtransienten klar zu beobachten. Dies vermeidet den Einsatz elektrischer Stimulation, was eine nicht-invasive Analyse von Mutanten ermöglicht, die die postsynaptische Kalziumdynamik beeinflussen.
Single-Fluorophor-GECIs, wie GCaMP, verwenden ein einzelnes fluoreszierendes Proteinmolekül, das mit der M13-Domäne der Myosin-Lichtkettenkinase an seinem N-Terminal-Ende und Calmodulin (CaM) am C-Terminus verschmolzen wird. Bei der Kalziumbindung erfährt die CaM-Domäne, die eine hohe Affinität zu Kalzium aufweist, eine Konformationsänderung, die eine nachfolgende Konformationsänderung im fluoreszierenden Protein zur Folge hat, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität1führt. GCaMP Fluoreszenz ist bei 488 nm angeregt, so dass es ungeeignet ist, in Verbindung mit Channelrhodopsin verwendet zu werden, das eine ähnliche Anregungswellenlänge von 473 nm hat. Um Kalziummessungen mit der Stimulation des Kanalrhodopsins zu koppeln, muss daher das grüne fluoreszierende Protein von GCaMP durch ein rotes fluoreszierendes Protein, mRuby (RCaMP), ersetzt werden. Die Verwendung des muskelausgedrückten RCaMP in Kombination mit der cholinergen motorischen Neuronenexpression von Channelrhodopsin ermöglicht Studien an der neuromuskulären Schnittstelle des Wurms (NMJ) bei gleichzeitiger Anwendung von Optogenetik und funktioneller Bildgebung innerhalb desselben Tieres. 2.
Der Einsatz von Channelrhodopsin umgeht die Notwendigkeit der elektrischen Stimulation, um die neuromuskulären Knoten von C. eleganszu depolarisieren, die nur in sezierten Präparaten erreicht werden können, wodurch diese Technik sowohl einfacher zu verwenden als auch präziser zu machen ist. wenn bestimmte Gewebe gezielt werden. Zum Beispiel, Channelrhodopsin wurde zuvor in C. elegans verwendet, um bestimmte Neuronen reversibel zu aktivieren, was entweder zu einer robusten Aktivierung der exzitatorischen oder hemmenden Neuronen3,4. Der Einsatz einer lichtstimulierten Depolarisation umgeht auch das Problem der neuronalen Schäden durch die direkte elektrische Stimulation. Dies bietet die Möglichkeit, die Auswirkungen vieler verschiedener Stimulationsprotokolle, einschließlich anhaltender und wiederholter Stimulationen, auf die postsynaptische Kalziumdynamik4zu untersuchen.
Die transparenzliche Natur von C. elegans macht es ideal für die fluoreszierende bildgebende funktionelle Analyse. Jedoch, bei der Stimulierung der exzitatorischen Acetylcholin-Neuronen an der NMJ, Tiere werden erwartet, mit einer sofortigen Muskelkontraktion reagieren4, so dass die Immobilisierung der Würmer entscheidend bei der Visualisierung diskreter Kalziumveränderungen. Traditionell werden pharmakologische Wirkstoffe verwendet, um die Tiere zu lähmen. Ein solches Medikament verwendet wird, ist Levamisol, ein cholinerge Acetylcholin-Rezeptor-Agonist5,6,7. Da Levamisol zur anhaltenden Aktivierung eines Subtyps von exzitatorischen Muskelrezeptoren führt, ist dieses Reagenz für die Untersuchung der Muskelkalziumdynamik ungeeignet. Die Wirkung von Levamisol induziert eine postsynaptische Depolarisation, erhöht das zytosolische Kalzium und schließt Beobachtungen nach präsynaptischer Stimulation aus. Um die Verwendung von lähmenden Medikamenten zu vermeiden, untersuchten wir zwei alternative Methoden, um C. elegansimmobilisieren. Die Tiere wurden entweder verklebt und dann aufgeschnitten, um die Körperwandmuskeln freizulegen, ähnlich der bestehenden C. elegans NMJ Elektrophysiologie-Methode8, oder Nanoperlen wurden verwendet, um intakte Tiere immobilisieren9. Beide Verfahren ermöglichten reproduzierbare Messungen der ruhenden und evozierten Muskelkalziumtransienten, die leicht quantifizierbar waren.
Die Methoden in diesem Papier können verwendet werden, um die grundlegenden zytosolischen Kalziumspiegel und Transienten in postsynaptischen Körperwandmuskelzellen in C. eleganszu messen. Beispiele für Daten, die die beiden verschiedenen Immobilisierungstechniken verwenden, werden genannt. Beide Techniken nutzen die Optogenetik, um die Muskelzellen ohne elektrische Stimulation zu depolarisieren. Diese Beispiele zeigen die Machbarkeit dieser Methode bei der Bewertung von Mutationen, die die postsynaptische Kalziumbehandlung in den Würmern beeinflussen, und weisen auf die Vor- und Nachteile der beiden Immobilisierungsansätze hin.
Protocol
Representative Results
Discussion
GECIs sind ein leistungsfähiges Werkzeug in c. elegans Neurobiologie. Frühere Arbeiten haben Kalzium-Bildgebungstechniken verwendet, um eine Vielzahl von Funktionen in Neuronen und Muskelzellen zu untersuchen, einschließlich sensorischer und Verhaltensreaktionen, mit verschiedenen Methoden der Stimulation. Einige Studien haben chemische Reize verwendet, um Kalziumtransienten in sensorischen ASH-Neuronen22,23 auszulösen oder Kalziumwellen in den Rache…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Alexander Gottschalk für ZX1659, den RCaMP und Channelrhodopsin mit Wurmstamm, Dr. Hongkyun Kim für den Slo-1(eg142) Wurmstamm und das National Bioresource Project for the sca-1(tm5339) Wurmstamm.
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
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