Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること
Summary
Lck:eGFP遺伝子導入ゼブラフィッシュの T リンパ球、高い GFP を表現・ T 細胞の開発と急性リンパ性白血病の研究に使用されています。この行より低いレベルでlckを表現研究 B 細胞に使用できます。このプロトコルでは、 lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞の浄化について説明します。
Abstract
ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、リンパ球の開発を研究する強力なモデルです。哺乳類のようなD. 形態学は、B および T リンパ球を含む適応免疫システムを所有しています。ゼブラフィッシュ リンパ球産生の研究は困難D. 学セル表面のマーカーを認識する抗体一般に利用できないため、複雑に B 系列を含む異なるリンパ球集団の分離と性状セルです。系統特異蛍光式と形質転換線は、このような課題を回避するために使用します。遺伝子組換えlck:eGFPラインD. 学T 細胞の開発、研究に使用されている、モデル T 細胞の開発と急性リンパ性白血病 (T オール) にも利用されています。Lck:eGFP魚は、T 系列の分析に広く使用されている、B 細胞を研究するために使用されてしていません。最近、低レベルとはいえ多くのゼブラフィッシュ B 細胞がまたlckを表現我々 発見。その結果、 lck:eGFP B 細胞同様に GFP の低レベルを表現します。この発見に基づき、今回lck:eGFPゼブラフィッシュから B 系細胞を浄化するためのプロトコルを開発しました。本手法は、 lck:eGFP魚や二重遺伝子組換えrag2:hMYC; などの関連行から B 細胞を浄化する蛍光活性化細胞選別機 (FACS) を利用する方法をについて説明しますlck:eGFP魚。これらの行は、B 細胞、特に未熟な B 細胞、低ですが検出可能なレベルで特急 GFP は高い GFP を発現する T 細胞と区別されるべきそれらを許可します。B 細胞は骨髄、胸腺、脾臓、血液や他の組織から分離することができます。このプロトコルは、浄化D. 学B 細胞、B 細胞、B リンパ球の悪性腫瘍のようなトピックに焦点を当てた研究を可能にする新しい方法を提供します。
Introduction
ゼブラフィッシュでは、遺伝的手法を用いた研究の脊椎動物の開発を促進する遺伝的操作性, 高産卵、光透光性および急速な発展などの強力な属性を提供しています。魚類と哺乳類の造血の共有の機能と共に、これらの利点によりD. 学成人期にわたって幼生の初期の外観から、リンパ球産生やリンパ球機能の in vivo 解析に最適。哺乳類と共有されている保存されている遺伝的プロセスに依存して血ゼブラフィッシュの開発と適応免疫システムにこれらを拡張します。さらに、リンパ球の開発を支配する分子メカニズムは、ゼブラフィッシュと哺乳類1間著しく保存されます。
過去 2 年間、トランスジェニックD. 学そのラベルの特定血液系統とこれらの系統の欠損突然変異系統は、2,3,4,5を作成されています。Lck:eGFP形質転換線、これらの 1 つはドライブ GFP 式6にゼブラフィッシュ リンパ球の蛋白質チロシンのキナーゼ (lck) プロモーターを使用します。T 系列の前駆体と成熟した T リンパ球が強く表現される遺伝子は胸腺 T 細胞性と T – 細胞の生体内浄化 ex 追跡 FACS7を生体内でことができます。以前は、我々 は前方遺伝 ENU 変異画面でこのラインを使用 T すべてになりやすい生殖細胞系列変異を識別するために、T 細胞の発癌8,9にリンク アデノーマを取得した遺伝的イベントを研究します。
最近、当研究室は、 lck:eGFPゼブラフィッシュの有用性をさらに拡張。二重遺伝子rag2:hMYC (人間 MYC)、 lck:eGFP + 学T オール10を開発する知られているで、私たちはことを発見した B 系統すべてはまた11を発生します。GFP 発現による鮮やかな蛍光を発する、このモデルで T オールとは異なり B すべてがぼんやりと発光 GFP レベルが低いため魚 B オール蛍光顕微鏡による T すべてとのそれらから肉眼的に区別するを許可します。また、この GFP 発現は GFPlo B 全細胞の分離から GFPこんにちはFACS11を使用してすべての T 細胞に許可します。また、低lck式にはLCK11,12の人間 B オールもエクスプレス低レベルとして、ゼブラフィッシュ、B オールに一意ではありません。同様に、 d. 学マウス、および人間の細胞の B 系統もlckの低レベルを表現/LckLCK、未熟な B 細胞の持つ最高の式11,13/。セルごとにlckeGFPゼブラフィッシュまたは誘導体の線に B 系細胞は、T リンパ球、くらい GFP 1-10% を表現します。これら GFPlo表現特性pax5、 cd79b、 blnk、 btk, ighm、 ighz、その他、B 細胞の Mrna を細胞、骨髄、胸腺、脾臓、または周辺から精製することができます。血11。したがって、両方 B- と T-系列細胞にすることができますおよび分離されたlckeGFPゼブラフィッシュからrag2hMYC、 lckeGFP動物、B と T、すべて細胞同様の場合11。
ここでは、我々 はlck:eGFPゼブラフィッシュとrag2hMYC; の非悪性または悪性 B 細胞から非悪性 B 細胞を FACS 浄化効率を私達のプロトコルを提示します。lck:eGFP魚、ソースのさまざまな組織を使用して。必要な場合、そのような細胞を FACS 分離せずフローサイトメトリーによる定量化同様にことができます。低lck式の発見-その結果、GFP の発現が低い -b 細胞のlckeGFPゼブラフィッシュの実験的な可能性の新たな扉を開きますin vivo B 細胞発達研究のよう。したがって、2004 年に最初に報告されたこの形質転換線は、活用するゼブラフィッシュ適応免疫に関する新鮮な洞察を収集することを目指す新しい生活です。
Protocol
Representative Results
Discussion
開発、B 系列ラベル3,4 D. 学モデルにこれを追加するlck:eGFP遺伝子導入ゼブラフィッシュから B 細胞を分離するためのプロトコルを提供しています。幾分意外にも、GFPlo B 細胞のこの行の識別は、2004 年にその説明から見過ごされている行った。一般的に、lckは T 細胞に固有の6と見なされますが、最近の?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはゼブラフィッシュのケアのためのミーガン マローン-ペレスと OUHSC の流れの cytometry コアに感謝したいと思います。この作業は、車輪、科学の進歩と技術 (HRP-067)、NIH/日の出 INBRE パイロット プロジェクト賞 (P20 GM103447) オクラホマ センター現代希望からの補助金によって支えられました。大会では、E.L. & テルマ ゲイロードの寄附で小児血液腫瘍学の子供の病院財団が保持しています。
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
Referencias
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
