Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain

Summary

Ici, deux essais de débit moyen pour l’évaluation des effets sur Ca^{2 +}-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain sont décrites. Ces tests peuvent servir à l’écran rapidement et facilement de grandes quantités de composés aux effets sur la Ca^{2 +}-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain.

Abstract

Ca^{2 +}-signalisation est essentielle à la fonction normale des cellules de sperme et la fertilité masculine. De même, la réaction de l’acrosome est vitale pour la capacité d’une cellule de sperme humaine à pénétrer dans la zone pellucide et féconder l’ovule. Il est donc très intéressant pour tester des composés (par exemple, les produits chimiques environnementaux ou candidats-médicaments) pour leur effet sur Ca^{2 +}-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain soit à examiner les effets négatifs potentiels sur la fonction des cellules de sperme humain ou d’enquêter sur un possible rôle comme contraceptif. Ici, deux essais de débit moyen sont décrits : 1) un essai pour l’évaluation des effets sur Ca^{2 +}fluorescence-signalisation dans le sperme humain et 2) un dosage de cytométrie en image pour évaluation de la réaction de l’acrosome dans le sperme humain. Ces tests peuvent être utilisés pour dépister un grand nombre de composés aux effets sur la Ca^{2 +}-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain. En outre, les dosages peuvent être utilisés pour générer des courbes dose-réponse très spécifique des composés individuels, déterminer l’additivité/synergie potentielle pour plusieurs composés et d’étudier le mode pharmacologique d’action par l’intermédiaire de l’inhibition compétitive expériences avec des inhibiteurs de la revendication.

Introduction

Les deux essais décrits ici vise à étudier les effets sur Ca^{2 +}-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain, comme l’a montré pour plusieurs composés dans plusieurs publications qui emploient ces dosages^{1,2, 3,4,5,6,7}. Ca^{2 +}-signalisation et la réaction de l’acrosome sont fonction des cellules de sperme humain vital à la normale et la fertilité masculine.

L’objectif général d’une cellule de sperme humaine consiste à féconder l’ovule. Pour pouvoir correctement et naturellement féconder l’ovule, les fonctions de la cellule de sperme doivent être réglementées étroitement pendant le trajet des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur féminin^8,9. Les fonctions de la cellule de sperme sont réglementées via l’intracellulaire Ca^{2 +}-concentration [Ca^{2 +}]_j’ai (par exemple, selon la réaction acrosome, chimiotactisme et la motilité de sperme)¹⁰. En outre, un processus de maturation, appelé la capacitation, qui rend les spermatozoïdes capables de féconder l’ovule, est partiellement réglementé par [Ca^{2 +}]_j’ai¹⁰. Ca^{2 +}-extrusion Ca^{2 +}-ATPase pompes¹¹ maintenir un pli environ 20.000 Ca^{2 +}-dégradé sur la membrane de la cellule de sperme humain, avec un repos [Ca^{2 +}]_j’ai de 50 à 100 nM. Si Ca^{2 +} est autorisé à traverser la membrane cellulaire (par exemple, par le biais de l’ouverture du Ca^{2 +}-canaux), un afflux considérable de Ca^{2 +} se produit, donnant lieu à une altitude de [Ca^{2 +}]_i. Toutefois, le spermatozoïde porte également intracellulaire Ca^{2 +}-magasins, qui peuvent libérer Ca^{2 +} et, par conséquent, également donner lieu d’altitude [Ca^{2 +}]_i¹². Fait intéressant, tous médiée par les canaux Ca^{2 +}-afflux dans les spermatozoïdes humains constate jusqu’à présent à se produire par l’intermédiaire de CatSper (chatde canal ionique de Sperm), qui n’est exprimée dans les cellules spermatiques¹¹. Dans les spermatozoïdes humains, CatSper est activé par la progestérone ligands endogènes et les prostaglandines par distincte ligand binding sites^13,14,15, conduisant à une rapide Ca^{2 +}-afflux dans la cellule de sperme. Deux principales sources près de le œuf fournissent des niveaux élevés de ces ligands endogènes. L’un est le liquide folliculaire contenant des niveaux élevés de progestérone¹⁶. Le liquide folliculaire est libéré des follicules à maturité ainsi que de le œuf à l’ovulation et les mélanges avec le fluide dans les oviductes¹⁷. L’autre source principale est les cellules du cumulus qui entourent le œuf et émettent des niveaux élevés de progestérone et les prostaglandines. La progestérone induite par Ca^{2 +}-afflux dans les cellules de sperme s’est avéré de médiation chimiotactisme vers l’oeuf^9,18, contrôler la motilité de sperme^19,20 et stimuler l’acrosome ²¹de réaction. Déclenchement de ces individuels [Ca^{2 +}]_i-fonctions de sperme réglementé dans le bon ordre et au bon moment est crucial pour la fécondation de l’ oeuf⁸. Dans ce cadre, un sous-optimale induite par la progestérone Ca^{2 +}-afflux a été trouvé pour être associé à réduit la fertilité mâle^{22,23,24,25,26 ,27,28,29} et fonctionnelle CatSper est essentiel pour la fertilité masculine^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

Comme les spermatozoïdes atteignent l’ovule, une séquence d’événements doit avoir lieu pour la fécondation se produise : 1) les spermatozoïdes doivent pénétrer la couche de cellules de cumulus environnantes, 2) lier à la zone pellucide, 3) exocytose le contenu acrosome, la réaction de ce que l’on appelle acrosome ³⁷, 4) pénétrer dans la zone pellucide et 5) fusionnent avec la membrane de l’oeuf pour compléter la fertilisation³⁸. Pour pouvoir passer par ces étapes et féconder l’ovule, le spermatozoïde doit tout d’abord subir capacitation¹¹, qui commence comme les spermatozoïdes laisser le liquide séminal contenant « decapacitating » facteurs³⁹ et nager dans les fluides de la femelle appareil reproducteur avec des niveaux élevés de bicarbonate et albumine³⁷. Capacitation rend les spermatozoïdes capables de subir une hyperactivation, une forme de mobilité avec une raclée vigoureuse du flagelle et acrosome réaction³⁷. Hyperactivé motilité est requise pour la pénétration de la zone pellucide⁴⁰et l’acrosome contient diverses enzymes hydrolytiques qui facilitent ce processus de pénétration⁴¹. En outre, la réaction de l’acrosome restitue les spermatozoïdes capables de fusionner avec l’oeuf en exposant des protéines membranaires spécifiques sur la surface de sperme nécessaire pour la fusion de spermatozoïde-ovule⁴². Par conséquent, la possibilité de subir une réaction hyperactivation et acrosome sont tous deux requis pour la fécondation réussie de l’oeuf^40,42. Contrairement à ce qui a été vu pour la souris spermatozoïdes^43,44,45, spermatozoïdes seulement humains qui sont acrosome intacte peut lier à la zone pellucide⁴⁶. Lorsque les spermatozoïdes humains sont liés à la zone pellucide, ils devront subir la réaction de l’acrosome fois à pénétrer dans la zone pellucide⁴¹ et d’exposer des protéines membranaires spécifiques qui sont nécessaires pour la fusion avec l’ oeuf³⁸. Le moment de la réaction de l’acrosome dans le sperme humain est donc critique pour la fécondation se produise.

Comme décrit plus haut, Ca^{2 +}-signalisation est vitale pour la fonction⁸de cellules de sperme normal, et c’est donc un grand intérêt pour être en mesure à l’écran un grand nombre de composés aux effets sur la Ca^{2 +}-la signalisation dans les spermatozoïdes humains. De même, comme des spermatozoïdes seulement humains qui subissent une réaction de l’acrosome au bon moment et au lieu peut pénétrer la zone pellucide et féconder l’ovule^46,47, il est également très intéressant pour pouvoir tester les composés pour leur capacité à influent sur la réaction de l’acrosome dans le sperme humain. À cette fin, deux essais de criblage à moyen débit sont décrits : 1) une analyse des effets sur Ca^{2 +}-signalisation dans les spermatozoïdes humains et 2) un test de la capacité d’induire de réaction de l’acrosome dans les spermatozoïdes humains.

Essai 1 est un moyen débit Ca^{2 +}-dosage de signalisation. Cette technique d’axée sur le lecteur sur la plaque de la fluorescence surveille les changements de fluorescence en fonction du temps simultanément dans plusieurs puits. Le Ca^{2 +}-colorant fluorescent sensible, Fluo-4 a un K_d pour Ca^{2 +}≈ 335 nM et est perméable à la cellule sous la forme d’ester de AM (acétoxyméthyl). À l’aide de Fluo-4, il est possible de mesurer les changements [Ca^{2 +}]_i au fil du temps et après l’ajout de composés d’intérêt pour les spermatozoïdes. Le test a été développé par le laboratoire de Timo Strünker 2011¹³ et a depuis été utilisé dans plusieurs études aux composés de l’écran pour les effets sur Ca^{2 +}-signalisation dans le sperme humain^{1,2,3, 4,5}. Aussi, une méthode similaire a servi à plusieurs médicaments candidats⁴⁸de l’écran. En outre, ce test est également utile pour évaluer le mode pharmacologique de l’action^1,2,3,4,5, relation dose-effet courbes^{1, 2,3,4,5}, inhibition compétitive^1,2, additivité^1,2et synergie³ de composés d’intérêt.

Dosage 2 est un test de réaction moyen débit acrosome. Cette technique de base cytomètre image mesure la quantité de viable acrosome réagi spermatozoïdes dans un échantillon à l’aide de trois colorants fluorescents : iodure de propidium (PI), couplé à la FITC lectine de Pisum sativum (FITC-PSA) et Hoechst 33342. Le test a été modifié d’une méthode similaire d’axée sur la cytométrie de flux par Zoppino et al.,⁴⁹ et a été utilisé dans plusieurs études^6,7. En ce qui concerne le Ca^{2 +}-signalisation dosage, ce test de réaction acrosome pourrait également servir à évaluer les courbes dose-réponse, inhibition, additivité et la synergie des composés d’intérêt.

Protocol

La collecte et l’analyse des échantillons de sperme humain dans les protocoles suit les directives de la Research Ethics Committee de la région de la capitale du Danemark. Tous les échantillons de sperme ont été obtenus après consentement éclairé des donneurs volontaires. Après l’accouchement, les échantillons ont été totalement anonymisées. Pour leurs inconvénients chaque donateur reçoit une taxe de 500 couronnes danoises (environ $75 dollars US) par exemple. Les échantillons ont été analysés le j…

Representative Results

Représentant résulte d’une expérience de tester l’effet de 4 composés (A, B, C et D) avec un positif (la progestérone) et le contrôle négatif (tampon) sur [Ca2 +]i dans le sperme humain en utilisant le débit moyen Ca2 +-signalisation test peut être vu dans la Figure 4 a. Dans la Figure 4 b, une courbe dose-réponse de la progestérone est montrée, qui a été dérivé de pic ΔF/F<su…

Discussion

Le débit moyen Ca^{2 +} signalisation est basé sur des mesures de fluorescence des micropuits unique chaque contenant environ 250 000 spermatozoïdes. Le signal capturé est en moyenne de toutes les cellules de sperme individuels dans le puits. Le test fournit donc qu’aucune information spatiale sur l’endroit où plus précisément dans la cellule de sperme [Ca^{2 +}]_j’ai n’est changée, comment grand une proportion des spermatozoïdes [Ca^{2 +}]_i un changement a lieu…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer