Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus
Summary
Wij presenteren experimentele benaderingen voor studeren RNA-interactors van double-stranded RNA bindend proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) tijdens de zoogdieren celcyclus met behulp van HeLa cellen. Deze methode maakt gebruik van formaldehyde dwarslijn RNA-PKR complexen en immunoprecipitation te verrijken van PKR-gebonden RNAs. Deze RNAs kunnen verder worden geanalyseerd door middel van high-throughput sequencing of qRT-PCR.
Abstract
Proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) is een lid van de ingeboren immune reactie-eiwitten en de secundaire structuur van de double-stranded van virale RNAs herkent. Wanneer verbonden met de virale double-stranded RNAs (dsRNAs), ondergaat PKR dimerisatie en latere autophosphorylation. Gefosforyleerd PKR (pPKR) wordt geactiveerd en induceert fosforylering van de alpha subeenheid van eukaryotische initiatie factor 2 (eIF2α) om te onderdrukken van globale vertaling. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat PKR onder fysiologische omstandigheden, zoals tijdens de celcyclus of onder verschillende stress omstandigheden zonder infectie kan worden geactiveerd. Ons begrip van de RNA-activators van PKR is echter beperkt door het gebrek aan een gestandaardiseerde experimentele methode vastleggen en analyseren van PKR-interactie dsRNAs. Hier presenteren we een experimenteel protocol bij specifiek verrijken en analyseren van PKR gebonden RNAs tijdens de cyclus van de cel met behulp van HeLa cellen. Wij gebruiken de efficiënte crosslinking activiteit van formaldehyde te lossen PKR-RNA complexen en isoleren ze via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs kunnen vervolgens verder worden verwerkt voor het genereren van een hoge-doorvoer sequencing-bibliotheek. Een belangrijke klasse van PKR-interactie cellulaire dsRNAs is mitochondriale RNAs (mtRNAs), die kunnen bestaan als intermoleculaire dsRNAs door complementaire interactie tussen de zware-strand en de RNAs licht-strand. De strandedness van deze duplex mtRNAs studeren, presenteren wij ook een protocol voor strand-specifieke qRT-PCR. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de analyse van PKR-gebonden RNAs, maar het kan eenvoudig worden aangepast om te bestuderen van cellulaire dsRNAs of RNA-interactors van andere dsRNA bindende proteïnen.
Introduction
Proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR), ook bekend als eukaryotische initiatie factor 2-alpha kinase 2 (EIF2AK2), is een goed gekarakteriseerd proteïne kinase dat door RNAs verstrekte informatie doorgeeft. Het behoort tot de eukaryote vertaling Inleiding 2 subeenheid alpha (eIF2α) kinase familie en kinaseenzym eIF2α op serine 51 in reactie op de infectie te onderdrukken global translation1. In dit verband wordt PKR geactiveerd door virale double-stranded RNAs (dsRNAs), die een platform te voor PKR dimerisatie en autophosphorylation2 bieden. Naast eIF2α, kan PKR ook phosphorylate p53, insuline receptor substraat 1 remmer recombination en kinase c-Jun N-terminal (JNK) voor het regelen van de activiteit van talrijke signaaltransductie trajecten3,4,5, 6.
PKR was oorspronkelijk geïdentificeerd als een kinase dat phosphorylated eIF2α tijdens poliovirus infectie door het poliovirus’ dsRNAs7,8te herkennen. PKR is steeds gevonden veelzijdige rollen voorbij immuunrespons te spelen, en wordt haar afwijkende activering of storing geïmpliceerd in talrijke ziekten bij de mens. Geactiveerd/Phosphorylated PKR (pPKR) is vaak waargenomen tijdens apoptosis en is een gemeenschappelijk kenmerk van patiënten met degeneratieve ziekten, met name neurodegeneratieve ziekten zoals Huntingtons, Parkinson van, en de ziekte van Alzheimer9 ,10,11,12,13. Bovendien, is PKR geactiveerd onder verschillende stress toestanden in de metabole stress en warmte schok14,15,16,17. Aan de andere kant, resulteert remming van PKR in verhoogde celproliferatie en zelfs maligne transformatie18,19. PKR functie is ook belangrijk in de normale hersenfunctie en tijdens de celcyclus als het niveau van de pPKR verhoogde tijdens de M fase20,21,22. In dit verband pPKR onderdrukt globale vertaling en geeft aanwijzingen aan de mitotische signalering sleutelsystemen die vereist voor goede celdeling20 zijn. Bovendien, langdurige activering van PKR geresulteerd in G2/M fase celcyclus arrestatie in Chinese hamster ovary23 cellen. Bijgevolg, PKR fosforylatie wordt geregeld door de negatieve feedback-lus om ervoor te zorgen snelle deactiveren tijdens M/G1 overgang21.
Ondanks de brede waaier van PKR-functie is ons begrip van PKR activering beperkt als gevolg van het gebrek aan een gestandaardiseerde high-throughput experimentele aanpak om te vangen en het identificeren van dsRNAs die PKR kunt activeren. Eerdere studies hebben aangetoond dat PKR kan interageren met dsRNAs gevormd door twee omgekeerde Alu herhalingen (IRAlus)20,24, maar de mogelijkheid van het bestaan van extra cellulaire dsRNAs die PKR kunt activeren tijdens de celcyclus of onder stress voorwaarden in menselijke cellen was gebracht. De conventionele aanpak bij het identificeren van RNA-interactors van een RNA-bindende eiwit (RBP) maakt gebruik van UV-licht tot en met dwarslijn RNA-RBP complexen25,26,27. Een recente studie deze UV crosslinking benadering toegepast in een muis-systeem en geïdentificeerd dat kleine nucleolar RNAs PKR activering tijdens metabole stress16kunnen regelen. Door gebruik te maken van hoge crosslinking efficiëntie van formaldehyde, voorgesteld hebben we een alternatieve methode om te identificeren van PKR-interactie RNAs tijdens de celcyclus in HeLa cellen28. Een soortgelijke aanpak is toegepast om te bestuderen van andere dsRBPs zoals Staufen en Drosha29,30,31. We vonden dat PKR met verschillende soorten noncoding RNAs interageren kan zoals korte afgewisseld nucleaire element (sinus), lange afgewisseld nucleaire element (lijn), endogene retrovirus element (ERV), en zelfs alpha-satelliet RNAs. Daarnaast, toonden we dat PKR met mitochondriale RNAs (mtRNAs) interageren kan, welke vorm intermoleculaire dsRNAs door complementaire interactie tussen de zware-strand en het licht strand RNAs28. Een recente publicatie verder ondersteund onze gegevens dat sommige mtRNAs bestaan in de vorm van een dubbelzijdig en dsRNA sensoren zoals melanoom differentiatie-geassocieerde eiwit 5 voor het opwekken van interferon32kunt activeren. Nog belangrijker, worden de expressie en subcellular localisatie van mtRNAs gemoduleerd tijdens de celcyclus en door verschillende stressoren, die belangrijk zijn in hun vermogen om te regelen van PKR activering28kan zijn.
In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor een onlangs ontwikkelde formaldehyde crosslinking en immunoprecipitation (fCLIP) methode voor het vastleggen en analyseren van PKR-interactie RNAs tijdens de celcyclus. Wij demonstreren de methode ter voorbereiding van de celcyclus arrestatie monsters met behulp van thymidine en nocodazole. Vervolgens presenteren we het fCLIP-proces om te isoleren van de PKR-gebonden RNAs en een methode ter voorbereiding van high-throughput sequencing bibliotheek om te identificeren deze RNAs. Bovendien, bakenen we gedetailleerde procedures voor het analyseren van PKR-gebonden RNAs qRT-PCR gebruikt. Specifiek, presenteren we een omgekeerde transcriptie van strand-specifieke procedure voor het analyseren van de strandedness van mtRNAs. Het beschreven protocol is geoptimaliseerd voor HeLa cellen en PKR, maar belangrijke stappen zoals de voorbereiding van de celcyclus monster, fCLIP en strand-specifieke qRT-PCR analyse kunnen eenvoudig worden aangepast, bestuderen van cellulaire dsRNAs of identificeren van RNA interactors van andere dsRBPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het proces om te bereiden S of M fase-gearresteerd monsters wordt geïllustreerd in Figuur 1. Om arrestatie cellen in de S-fase, gebruikten we een methode van thymidine dubbele blok waar we getrakteerd cellen met thymidine twee keer met een 9u-release tussen efficiëntie te waarborgen hoge arrestatie (figuur 1A). Voor M fase arrestatie, we getrakteerd cellen eenmaal met thymidine gevolgd door een 9u-release en vervolgens nocodazole blok cellen op prometaphase (<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse regering ministerie van Wetenschappen en ICT (NRF-2016R1C1B2009886).
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
Referencias
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
- Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
- Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
- Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
- Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
- Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
- Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection – Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
- Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
- Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer’s disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
- Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer’s disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
- Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington’s disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
- Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
- Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
- Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
- Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
- Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
- Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
- Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
- Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
- Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
- Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
- Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
- Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3′ UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
- Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
- Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).
