Dissecação de locais de Ca^{2 +} sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca^{2 +}

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para Ca^{2 +} imagem em neurônios e células gliais, que permite que a dissecação de Ca^{2 +} sinais em resolução subcellular. Este processo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de geneticamente codificado Ca^{2 +} indicadores.

Abstract

Íon cálcio (Ca^{2 +}) é uma molécula de mensageiro intracelular universal que impulsiona múltiplas vias de sinalização, levando a diversas saídas biológicas. A coordenação de duas Ca^{2 +} sinal fontes — "Ca^{2 +} influxo" de fora da célula e "Ca^{2 +} libertado" do Ca2 + intracelular armazenar retículo endoplasmático (ER) — é considerado fundamentam os padrões espaço-temporais diversos de Ca ^{2 +} sinais que causam várias funções biológicas nas células. O propósito do presente protocolo é descrever um Nova Ca^{2 +} método de imagem que permite a monitoração do momento do "Ca^{2 +} influxo" e "Ca^{2 +} release". OER-GCaMP6f é um geneticamente codificado Ca^{2 +} indicador (Lino) composto por GCaMP6f, que é direcionado para a membrana externa do ER. OER-GCaMP6f pode monitorar Ca^{2 +} lançamento em uma maior resolução temporal que GCaMP6f convencional. Combinado com a membrana plasmática-alvo GECIs, o espaço-temporais Ca^{2 +} sinal padrão pode ser descrito em uma resolução subcellular. Os subcellular-alvo Ca^{2 +} indicadores descritos aqui são, em princípio, disponível para todos os tipos de célula, mesmo para a vivo em imagem de neurônios Caenorhabditis elegans . Neste protocolo, apresentamos Ca^{2 +} imagem latente nas células de linhas de células, neurônios e células gliais em culturas primárias dissociadas e descrever a preparação de estoque congelado de neurônios corticais de rato.

Introduction

CA^{2 +} sinais representam a elevação da concentração Ca^{2 +} intracelular. CA^{2 +} é o segundo mensageiro universal para as células eucarióticas. Usando Ca^{2 +}, células funcionam através de diversas vias de sinalização intracelulares e induzem várias saídas biológicas. Por exemplo, nos neurônios, liberação da vesícula sináptica no terminal pré-sináptica, expressão gênica no núcleo e indução da plasticidade sináptica no postsynapse são regulados por distintas Ca^{2 +} sinais de que precisamente, ativam o apropriado a jusante enzimas nos locais certo e com sincronismo exato¹.

Padrões específicos de spatiotemporal de Ca^{2 +} sinais ativam as enzimas específicas a jusante. CA^{2 +} sinais são gerados pela coordenação entre duas diferentes Ca^{2 +} fontes: Ca^{2 +} influxo do espaço extracelular e Ca^{2 +} lançamento do retículo endoplasmático (ER), que serve como uma Ca intracelular^{2 +} loja. O significativo spatiotemporal Ca^{2 +} sinalização padrão para induzir uma função de célula específica também é suportado pelo nanodomains de 10 a 100 µM Ca^{2 +} gerado nas proximidades de Ca^{2 +} canais na membrana plasmática ou membrana de ER². Importante, a fonte de Ca^{2 +} sinais é um dos fatores mais críticos determinando a saída biológica a jusante. Nos neurônios, influxo de Ca^{2 +} e liberação de Ca^{2 +} têm efeitos opostos sobre o agrupamento de ácido gama - aminobutírico (GABA)_A receptores (GABA_AR) nas sinapses gabaérgica, que é responsável para a inibição da excitabilidade neuronal³. CA^{2 +} influxo acompanhado de excitação neuronal maciça induz a dispersão dos aglomerados de GABA_AR sinápticas, Considerando que o persistente Ca^{2 +} versão do PS promove a aglomeração de sináptica GABA_ARs. Outros grupos também relataram que a direção de ajuste dos cones de crescimento é criticamente dependente da fonte do sinal de Ca^{2 +} : induz o influxo de Ca^{2 +} repulsão, enquanto a liberação de Ca^{2 +} orienta a atração do crescimento neuronal cone⁴. Portanto, para compreender o Ca^{2 +} sinalização de caminhos subjacentes saídas celulares específicas, é importante identificar a fonte de Ca^{2 +} sinais descrevendo Ca^{2 +} sinais na resolução subcellular.

Neste protocolo, descrevemos um Ca^{2 +} método de imagem para Ca^{2 +} os sinais na resolução subcelular, que permite a estimativa das Ca^{2 +} fontes de sinal (Figura 1). CA^{2 +} microdomains logo abaixo da membrana plasmática com êxito são monitorados por geneticamente codificado Ca^{2 +} indicadores (GECIs) direcionados para a membrana plasmática através de penhora de sinal a membrana plasmática-localização Lck dentro Src quinase para a N-termini do GECIs⁵. Para detectar o Ca^{2 +} sinal padrão nas proximidades do ER em uma melhor resolução espacial e temporal, recentemente desenvolvemos OER-GCaMP6f, no qual GCaMP6f⁶ alvos a ER exterior da membrana, usando a proteína transmembrana de ER. OER-GCaMP6f com sensibilidade pode relatar Ca^{2 +} lançamento da emergência em uma melhor resolução spatiotemporal do que GCaMP6f convencional de células COS-7⁷ e de células HEK293⁸, evitando a difusão de Ca^{2 +} e GECIs . Também confirmamos que a espontânea Ca^{2 +} elevação no culturas astrócitos hippocampal relatado por OER-GCaMP6f mostrou um padrão spatiotemporal diferente em comparação com monitorado pelo GCaMP6f membrana plasmática-alvo (Lck-GCaMP6f)^{7 ,9}, indicando que o Ca^{2 +} imagem com OER-GCaMP6f em combinação com Lck-GCaMP6f contribui para a dissecação de Ca^{2 +} sinais na resolução subcellular para identificar suas fontes.

Atualmente, detalhamos o protocolo para o Ca^{2 +} sinal dissecção em células HeLa e neurônio-astrocyte misturadas culturas chapeadas em lamelas de vidro. A Ca^{2 +} técnica de imagem com GECIs indicado aqui, Lck-GCaMP6f, plasma-membrana-alvo RCaMP2¹⁰ (Lck-RCaMP2), e OER-GCaMP6f (Figura 1) são aplicáveis a todas as células em que estes GECIs podem ser expressa.

Protocol

Todos os experimentos descritos aqui foram aprovados pelo Comité de segurança RIKEN e Comissão de animais de experimento, de acordo com a orientação emitida pelo Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do japonês.

1. preparação das células

1. Preparação de poli (etilenoimina)-revestido de lamelas
   Nota: Revestimento Poly(ethyleneimine) (PEI) é recomendado para o aparelho de vidro, pois permite que os neurônios e astrócitos para fixar firmemente as lamelas sem impedir o seu desenvolvimento. No entanto, outros métodos de revestimento (por exemplo, poli-ornitina, poli L-lisina, laminina revestimento) também estão disponíveis, se necessário, para pratos de vidro-fundo.
   1. Coloque uma lamela de vidro de 18 mm de diâmetro em cada poço de uma placa de 12. Prepare a solução de PEI de 0,04% (12,5 mL/12-placa) usando água esterilizada.
   2. Adicione 1 mL de solução a 0,04% PEI a cada poço. Certifique-se de que não há nenhuma bolha por baixo as lamelas.
   3. Incubar as placas numa incubadora de CO₂ durante a noite a 37 ° C.
   4. No dia seguinte, lave as lamelas revestidas 3 x com 1 mL de água esterilizada. Remover a solução de PEI com um aspirador, adicionar 1 mL de água esterilizada a cada poço e agitar a placa de 12 poços, para que a solução de PEI entre a lamínula e a placa pode ser lavada para fora completamente. Como o restante PEI é tóxico para as células, certifique-se de que a água após a lavagem final é aspirada completamente.
   5. Secar e esterilizar as lamelas dentro do capô com radiação ultravioleta (UV) luz pelo menos 15 min. O prato de PEI-revestidos pode ser armazenado a 4 ° C por até 2 meses. Ilumine os pratos com UV luz durante 15 minutos imediatamente antes da utilização.
   6. Adicione 5 mL de água destilada estéril no espaço entre os poços para evitar a evaporação do meio de cultura.
2. Linhas de células de chapeamento
   Nota: Este protocolo fornece apenas um exemplo para transfeccao em células de linhas de células de mamíferos, tais como as células HeLa e células COS-7. Os usuários podem aplicar outros protocolos de transfeccao otimizadas para seus experimentos. Nesta seção, descreveremos o protocolo de cultura de células HeLa, que também se aplica às células COS-7.
   1. No dia anterior o transfeccao, cultura das células numa placa de cultura de 10cm até eles alcançar confluência de 70-90%.
   2. Escaldar o meio de cultura (ver Tabela de materiais) a 37 ° C.
   3. Lavar as células 2 x com tampão fosfato salino sem Ca^{2 +} e Mg^{2 +} (PBS [-]).
   4. Aspire o PBS(-), adicione 1 mL 0,5% tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) da solução de ácido e incube as celulas a 37 ° C por 90 s até que alcançar uma forma redonda.
   5. Adicione 9 mL do meio de cultura escaldado para parar a tripsinização. Dilua as células com meio de cultura a uma proporção de 1:6.
   6. 1 mL de células de diluídos em lamelas PEI-revestido nas placas de 12-poços de semente.
3. Preparação da cultura neurônio hippocampal-astrocyte misturada de ratos ou camundongos
   Nota: Seções 1.3 e 1.4 primeiro devem ser revisados e aprovaram por um Comité de usar e cuidados institucionais do Animal e devem seguir os procedimentos oficialmente aprovados para o cuidado e o uso de animais de laboratório. O fluxograma do protocolo cultura neuronal é mostrado na Figura 2.
   1. Prepare todos os reagentes sob o capô de fluxo laminar. Médio da águia modificados do lugar Dulbecco (DMEM) em dois 100 milímetros cultura pratos (aproximadamente 20 mL/prato) que estão em uma geladeira.
   2. Preparar 50 mL do meio de dissecação, composto por DMEM e 20mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) (ver Tabela de materiais) e dispense o meio em três pratos de cultura de 60 mm (aproximadamente de 7 mL/prato) e oito 35 mm pratos de cultura (aproximadamente 2 mL/prato). Coloca os pratos na outra geladeira.
   3. Preparar 50 mL de solução salina a incubação, composta por solução salina equilibrada Hanks, suplementada com 20 mM HEPES (ver Tabela de materiais) e colocar 8 mL de solução salina em um tubo cônico de 15 mL no gelo.
   4. Prepare o chapeamento suplementado com meio essencial mínimo (MEM) com B-27, glutamina e penicilina-estreptomicina (ver Tabela de materiais). Manter este meio em temperatura ambiente (20 – 28 ° C).
   5. Esterilize os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70%.
   6. Coloque uma toalha de papel em uma jarra de vidro com tampa e 1 mL de isoflurano. Deixe o isoflurano evaporar por 1 min.
   7. Coloque um rato grávido ou um rato no frasco preparado de acordo com a etapa 1.3.6 e manter o animal na jarra até que é profundamente anestesiada (cerca de 30 s a 1 min).
   8. Levar o animal anestesiado fora do frasco e desinfectar o animal e o equipamento de dissecação, pulverizando-os com etanol a 70%. Corte da linha mediana ventral com pinça e tesoura padrão de dissecação e extrair o útero da grávida ratazana ou rato.
   9. Extrair o útero de um rato fêmea anestesiado ou mouse, usando tesouras de dissecação delicadas, E18 e 19 embriões e colocar os embriões extraídos com uma pinça de anel em DMEM gelado em um prato de 10cm para frio anestesia.
   10. Decapitar o embrião com tesoura de dissecação bem e coloque a cabeça em DMEM gelado em um prato de 10 cm.
   11. Extrai o cérebro de cada embrião com 13 cm curvada Semken fórceps e pinças com pontas bem. Manter o cérebro no meio de dissecação gelado em um prato de 60 mm.
   12. Remover o hipocampo, usando duas pinças com pontas bem, no meio de dissecação gelada em pratos de 35mm e manter o tecido isolado em soro fisiológico a incubação colocado em um tubo cônico de 15 mL no gelo.
   13. Lave o hipocampo com solução salina de incubação e incubar com tripsina (1,25 mg/mL) e DNase eu (0,25 mg/mL) em soro fisiológico a incubação por 5 min a 37 ° C. O volume de incubação recomendada é 2,7 mL de soro fisiológico a incubação, 150 µ l de 20 x estoque tripsina e 150 µ l de 20 ações x DNase (ver Tabela de materiais).
   14. Lave o hipocampo 3 x com solução salina gelada de incubação.
   15. Aspirar o soro de incubação e adicione 1 mL do meio de chapeamento contendo DNase eu (10 µ l da solução estoque; ver Tabela de materiais). Suspender o tecido por pipetagem não mais do que 20 x e medir a densidade de células viáveis, usando um contador de célula e ensaio de azul de Tripan.
   16. Dilua as células hippocampal para uma densidade de 1,4 x 10⁵ viável células/mL para ratos e 2,5 x 10⁵ viável células/mL para os ratos. 1 mL das suspensões de célula diluídos sobre as lamelas PEI-revestido em placas de cultura 12-bem as sementes.
   17. Manter as células a 37 ° C numa incubadora de CO2 para 2-3 dias.
   18. Remova o meio de chapeamento. Não deixe que as células dessecar. Delicadamente e rapidamente adicionar o meio de manutenção escaldadas (ver Tabela de materiais).
4. Preparação de rato neurônio cortical-astrocyte misturada cultura e células congeladas e a revitalização de culturas congeladas
   Nota: Um método de criopreservação de células corticais foi descrito previously11. Aqui, um protocolo modificado no qual células corticais podem ser armazenadas a-80 ° C durante pelo menos 3 meses é fornecido. O fluxograma para este protocolo é mostrado na Figura 2.
   1. Prepare DMEM, dissecação média, solução salina de incubação e chapeamento médio conforme indicado em etapas 1.3.1–1.3.4 e a Tabela de materiais.
   2. Preparar o meio de lavagem constituído DMEM, soro bovino fetal inactivadas pelo calor e penicilina-estreptomicina (ver Tabela de materiais), se necessário.
   3. Extrair o útero de um rato fêmea anestesiado ou mouse, usando tesouras de dissecação delicada, E18 e 19 embriões e usar a pinça de anel para colocar cada embrião extraído em DMEM gelada para fria anestesia.
   4. Remover o cérebro de embriões e mantê-los no meio de dissecação gelada. Remover os corticais e mantê-las em soro fisiológico a incubação colocado em um tubo cônico de 15 mL no gelo.
   5. Lave as corticais com solução salina de incubação e incubar as corticais com tripsina (1,25 mg/mL) e DNase I (0,25 mg/mL) em solução salina de incubação por 5 min a 37 ° C. O volume de incubação recomendada para 12 corticais é 5,4 mL de solução salina de incubação, 300 µ l de 20 x estoque tripsina e 300 µ l de 20 ações x DNase eu.
   6. Lave as corticais 3 x com solução salina gelada de incubação.
   7. Remover o sobrenadante e adicionar 2 mL do chapeamento meio suplementado com 150 µ l de DNase estoque. Dissociar as células pipetando menos de 20 cursos e filtrar as células usando um coador de célula com um tamanho de poro de 70 µm.
   8. Lave o filtro de célula com 20 mL do meio de chapeamento para o chapeamento. Para a preparação de estoque de células congeladas, lavar as células com 20 mL de meio de lavagem (ver Tabela de materiais)
   9. Medir a densidade das células viáveis, usando um contador de células e o método de azul de Tripan.
   10. Diluir as células corticais para uma densidade de 1,4 x 10⁵ viável células/mL com o meio de chapeamento e adicione 1 mL da suspensão celular diluídos para lamelas PEI-revestido nas placas de cultura 12-bem.
   11. Manter as células a 37 ° C numa incubadora de CO₂ por 2-3 dias e alterar o meio de cultura para o meio de manutenção.
   12. Depois passo 1.4.9, prepare o estoque de célula cortical congelado por centrifugação as células a 187 x g durante 3 min, usando um rotor de balanço.
   13. Aspirar o sobrenadante e adicionar o meio de criopreservação (ver Tabela de materiais) mantido a 4 ° C, para obter uma densidade de células de 1 x 10⁷ células/mL. Alíquota de 1ml da suspensão de células em tubos criogênicos.
   14. Coloque os tubos em uma célula congelando o recipiente com uma taxa de congelamento de-1 ° C/min, até atingir uma temperatura de-80 ° C e transferir o recipiente de congelação para um freezer-80 ° C. As células podem ser armazenadas pelo menos 3 meses a-80 ° C.
   15. Para reavivar as células congeladas, escaldar a lavagem médio (aproximadamente 13 mL para cada tubo criogênico) e meio de manutenção para congelados células corticais (ver Tabela de materiais).
   16. Descongele as células congeladas rapidamente a 37 ° C, em banho-maria.
   17. Dilua as células descongeladas suavemente com o meio de lavagem escaldadas. Centrifugar as células a 187 x g durante 3 min, usando um rotor de balanço.
   18. Suspender o sedimento em 1 mL de meio de lavagem e medir a densidade de células viáveis.
   19. Dilua as células com o meio de manutenção de células corticais congelados produzir uma densidade de células de 3,0 x 10⁵ viável células/mL e sementes de 1 mL de suspensão de célula nas placas de 12-poços de PEI-revestido.

2. a expressão de membrana-alvo GECIs

1. Transfecção de células
   1. Adicionar 250 ng do plasmídeo Lino (i.e., Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ou OER-GCaMP6f com promotor CMV)^7,8,9 a 100 µ l do meio de soro reduzida (ver Tabela de materiais) por poço. Para o cotransfection de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, uso 250 ng de cada plasmídeo em 100 µ l de meio de soro reduzida em cada poço.
   2. Adicionar 0,5 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) por bem a mistura de soro do plasmídeo-reduzido médio. Para o cotransfection de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, adicione 0,5 µ l de reagente de transfeccao por bem.
   3. Incube a mistura por 30 min à temperatura ambiente (20 – 28 ° C).
   4. Adicione 100 µ l da mistura para cada lamela de forma algumas.
   5. Incube as celulas por 48-72 h numa incubadora de CO₂ a 37 ° C, para permitir a expressão dos GECIs.
2. Transfection e infecção de vírus adeno-associado de neurônios hippocampal ou corticais
   Nota: Transfecção in vitro de 3 – 5 dias (DIV) resulta em uma taxa mais elevada de Transfeccao para os neurônios. Transfecção em 6-8 DIV é preferida para a expressão ideal do GECIs em astrócitos. Para a expressão do GECIs nos neurônios de cultura dissociado após 9 DIV, a infecção dos vetores de vírus adeno-associado (AAV) fornece uma melhor eficácia de expressão. Vetores AAV para a expressão de Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f sob o EF1a promotores foram preparados conforme descrito anteriormente, usar HEK293 células¹² (ver Tabela de materiais).
   1. Para transfeccao 3 – 8 dias após o chapeamento, rótulo dois tubos, um para o Plasmídeo e o outro para o reagente de transfeccao.
   2. Adicionar 50 µ l de meio de soro reduzida (ver Tabela de materiais) por bem a cada tubo.
   3. Adicione 0,5 µ g de plasmídeo por lamela e 1 µ l de suplemento acompanhado de reagente de Transfeccao para neurônios (ver Tabela de materiais) por alvéolo ao tubo de DNA de plasmídeo. Para o cotransfection de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, 0,5 µ g de cada plasmídeo e 1 µ l de suplemento são misturados em 50 µ l de meio de soro reduzida por bem.
   4. Adicione 1 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) por alvéolo no tubo do reagente de transfeccao. A mesma quantidade de reagente de transfeccao é usada para cotransfection.
   5. Vórtice de ambos os tubos para 1-2 s.
   6. Adicione a mistura de reagente de transfeccao (da etapa 2.2.4) à mistura de DNA (da etapa 2.2.3). Misture pipetando suavemente e incubar a mistura (100 µ l por lamela) durante 5 min à temperatura ambiente.
   7. Carrega esta mistura sobre as células de forma algumas.
   8. Incube as células numa incubadora de CO₂ por 2-3 dias até que as proteínas de marcador são expressos.
   9. Para a infecção de AAV, adicione 3 µ l de AAV por alvéolo à cultura mista neurônio-astrocyte. Misture suavemente agite o prato. Para a dupla infecção de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, 3 µ l de cada AAV é introduzido por bem. No caso do número de células expressando GECIs são insuficiente, deve ser determinada a quantidade ideal de AAV para infecção.
   10. Manter a cultura por 1 – 2 semanas até que o GECIs são expressos.

3. Ca^{2 +} imagens

1. Imagem simultânea de células expressando Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f
   Nota: Para gravar simultaneamente os sinais Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, divisão de imagem óptica são necessários. A ótica permitem a separação de RCaMP2 e GCaMP6f e sua projeção para o mesmo quadro fotográfico da câmera (Figura 3A). Simultânea de imagens também requer fontes (1) luz que podem simultaneamente emitem luz em azul (450-490 nm) de excitação e espectros de verde (500-560 nm), filtro de banda dupla (2) e espelho dicroico define no microscópio, e (3) emissão de filtros para RCaMP2 e GCaMP6f. Para obter detalhes, consulte a Tabela de materiais.
   1. Liga os dispositivos de imagem e computadores, pelo menos 30 min antes da gravação. Escaldar o microscópio aquecimento câmara de 37 ° c. Configure o dispositivo de divisão de imagem, filtros e fonte de luz. Alinhe a ótica de divisão de imagem para que o mesmo campo de visão aparece na câmera. Escolher a lente objetiva apropriada (consulte a Tabela de materiais).
   2. Monte a lamela contendo as células transfectadas com Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f na câmara de gravação, adicione o buffer (400 µ l de lamelas de 18 mm) ou meio adequado de imagem na câmara e colocá-lo no palco microscópio. Coloque uma tampa na câmara para evitar a evaporação do meio de gravação.
   3. Localize as células expressando tanto Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f pela imagem fluorescente. Minimize a intensidade de luz de excitação para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade.
   4. Retire a tampa e começar uma gravação de lapso de tempo a 10 Hz. Durante esta gravação, adicione o agonista para a câmara para evocar^{Ca 2 +} respostas (por exemplo, a histamina para células HeLa, ATP para as células COS-7).
   5. Salve os dados de lapso de tempo na unidade de disco rígido (HDD).
   6. Analise os dados usando o software de análise de imagem.
2. Gravação de atividades espontâneas de astrócitos expressando Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f
   Nota: Sem divisão de imagem óptica, os sinais de Ca^{2 +} na membrana plasmática e aqueles ao seu redor a ER podem ser monitorados na mesma cela. Aqui, a gravação sequencial de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f nos astrócitos mesmos é descrita. Um objectivo de imersão de óleo com uma abertura numérica maior que 1.3 é altamente recomendado para espontânea Ca^{2 +} atividade.
   1. Ligue o microscópio, câmera, fonte de luz e o aquecimento do microscópio de câmara pelo menos 30 minutos antes da gravação.
   2. Montar a lamela contendo as células transfectadas com Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f na câmara de gravação e adicionar 400 µ l do meio de geração de imagens. Coloque uma tampa na parte superior da câmara.
   3. Escolha o filtro definido para GCaMP6f e a fonte de luz (azul da excitação, por exemplo, 470– 490 nm; ver Tabela de materiais). Localize os astrócitos expressando OER-GCaMP6f.
   4. Escolha um conjunto de filtro e a fonte de luz para RCaMP2 (sinal de excitação, por exemplo, 510-560 nm verde; ver Tabela de materiais) e confirme se a Lck-RCaMP2 é expressa nos astrócitos mesmos. Evite exposição prolongada a fonte de luz para evitar fotobranqueamento.
   5. Gravar imagens do tempo-lapso de Lck-RCaMP2 a 2 Hz para 2 min. salvar dados no disco rígido.
   6. Mude o filtro definido como que para GCaMP6f. Gravar imagens do tempo-lapso de OER-GCaMP6f no mesmo campo de visão, a 2 Hz para 2 min. salvar os dados no disco rígido.
   7. Analise os dados usando o software de análise de imagem.
3. Gravação de atividade neuronal espontânea e induzida por Ca^{2 +} elevação nos neurônios
   Nota: Configuração do microscópio para a imagem latente neuronal é idêntico ao descrito no ponto 3.2. Aqui, a imagem latente de Ca^{2 +} elevação espontânea devido a Lck-GCaMP6f e Ca^{2 +} elevação induzida pela ativação mGluR devido a OER-GCaMP6f é descrito.
   1. Para gravar a atividade neuronal espontânea, montar a lamela contendo as células expressando Lck-GCaMP6f na câmara de gravação e adicionar 400 µ l de meio de imagem. Coloque uma tampa na parte superior da câmara.
   2. Defina o filtro e a fonte de luz (excitação azul, por exemplo, 470 – 790 nm; ver Tabela de materiais) aos de GCaMP6f. Encontre os neurônios expressando Lck-GCaMP6f e mostrando atividade espontânea.
   3. Adquira imagens 2 Hz ou mais rápido. Salve os dados no disco rígido.
   4. Analise os dados usando o software de análise de imagem.
   5. Para gravar Ca^{2 +} elevação induzida, montar as lamelas que contém as células expressando OER-GCaMP6f com 400 µ l de imagem médio. Coloque uma tampa na parte superior da câmara.
   6. Usando o filtro definido para GCaMP6f, encontre os neurônios expressando OER-GCaMP6f.
   7. Retire a tampa. Inicie o lapso de tempo de gravação 2 Hz ou mais rápido. Durante a gravação, adicione as agonistas para um receptor acoplado à Gq-proteína (por exemplo, mGluR5 agonista [RS] - 3,5 - dihydroxyphenylglycine [DHPG]) para evocar uma liberação de Ca^{2 +} da emergência.
   8. Salvar as lapso de tempo imagens no disco rígido e analisar os dados.

Representative Results

Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f foram expressas em células HeLa, e ambos os sinais foram gravados simultaneamente divisão de imagem óptica, 24h depois do transfection (Figura 3A e vídeo 1). As imagens foram adquiridas em 10 Hz. histamina (dele, 1 µM), que induz o Ca^{2 +} lançamento da emergência, foi adicionado durante a gravação. O pedido dele, aumentou a intensidade do sinal de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, conforme mostrado pelo visor pseudocolorida de ΔF/F0, que representa a variação da intensidade da fluorescência inicial (Figura 3B). Os cursos de tempo de Ca^{2 +} elevação (ΔF/F0) relatados pelo Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f foram comparados na mesma região de interesse (ROI) (Figura 3). Os valores ΔF/F0 foram normalizados para seus valores de pico para permitir a comparação de curso do tempo entre os dois GECIs diferentes, que têm distribuições e níveis diferentes de expressão. Ambos os sensores relataram uma oscilação, como Ca^{2 +} elevação. Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f mostrou o mesmo tempo de curso para elevação de Ca^{2 +} em duas células entre os tipos de cinco célula examinados (Figura 3, ROI 1 e 3). No entanto, Ca^{2 +} elevações mostradas pela Lck-RCaMP2 permaneceram em um nível mais elevado em comparação ao mostrado por OER-GCaMP6f (Figura 3 C, ROI, 2, 4 e 5). Os resultados indicam que a elevação de Ca^{2 +} é prorrogada nas proximidades da membrana plasmática, enquanto que seja finalizada antes em torno da ER, que é a origem deste Ca^{2 +} sinal induzido por sua estimulação.

Espontânea Ca^{2 +} sinais de astrócitos no neurônio-astrocyte misturado a cultura do hipocampo de rato (Figura 4A) e corticais (Figura 4B) foram mostrados por Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f (Figura 4, vídeo 2, vídeo 3 de , Vídeo 4e vídeo 5). Culturas corticais foram revividas do estoque congelado que foi preparado como descrito no presente protocolo. Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f sinais sequencialmente foram gravados em 2 Hz a partir das mesmas células. Três ROIs foram selecionados na área que mostrou elevação de Ca^{2 +} por cada Lino, e o curso do tempo de ΔF/F_base (ou seja, a intensidade de fluorescência) alterado da intensidade da fluorescência média durante o período de gravação (F_base ). Quando a fluorescência de base é estável e Ca^{2 +} elevações são menos frequentes, F_base torna-se uma base útil para detectar eventos de elevação do Ca^{2 +} . Espontânea Ca^{2 +} elevações eram visíveis apenas no processo de hamartomas, não para o corpo da célula. Este resultado é consistente com os relatórios anteriores sobre hamartomas Ca^{2 +} sinais espontâneos por outros GECIs visualizado in-vitro¹³ e vivo em¹⁴. No hipocampo e corticais astrócitos, Ca^{2 +} elevações mostradas pela Lck-RCaMP2 (topo) foram mais frequentes do que as mostradas pela OER-GCaMP6f. Este resultado é consistente com nossa demonstração anterior que Ca^{2 +} elevações em astrócitos devido a Lck-GCaMP6f foram detectadas mais frequentemente do que as causadas por OER-GCaMP6f⁷ e sugere que esta noção também é aplicável na nível de célula única.

Espontânea Ca^{2 +} elevações por Lck-GCaMP6f em neurônios hippocampal do rato imaturo (DIV 10) foram vistas em 2 Hz (Figura 5A e 6 de vídeo). Os cursos de tempo de ΔF/F0 em cinco diferentes ROIs sugerem que estas elevações de Ca^{2 +} são localmente confinadas aos domínios subcellular. Figura 5B (Vídeo 7) mostra^{as Ca 2 +} respostas nos neurônios hippocampal do rato maduro (DIV 30) infectadas com vetores AAV OER-GCaMP6f-expressão. Os neurônios foram estimulados com 100 µM DHPG, que é o agonista de receptores metabotrópicos de glutamato, induzindo a liberação de Ca^{2 +} . Induzida por DHPG Ca^{2 +} versão devido a OER-GCaMP6f foi detectado.

Figura 1: diagrama mostrando a membrana-alvo GECIs. Diagrama esquemático da membrana plasmática-alvo GECIs (Lck-GCaMP6f e Lck-RCaMP2) e ER exterior membrana-alvo GCaMP6f (OER-GCaMP6f).

Figura 2: fluxograma para a preparação de células corticais e hippocampal transfeccao Plasmideo e infecção de AAV. As imagens microscópicas são representativos, recém chapeado DIV-6 células corticais (à esquerda) e células do estoque congelado (à direita) é revivido. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: exemplo da imagem simultânea de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f em células HeLa. (A) representação esquemática da separação de sinal com a divisão de imagem óptica. Projeta-se simultaneamente o mesmo campo de visão para Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f da câmera. Uma gravação representante adquirida a 10 Hz por uma câmera do CMOS é fornecida em Video 1, e um quadro da gravação é mostrado no painel A (à direita). (B) imagens de pseudo cor de ΔF/F0 para Lck-GCaMP2 (topo) e OER-GCaMP6f (parte inferior). Histamina (dele, 1 µM) foi adicionada no representante de (C) 0 s. curso de hora ΔF/F0 normalizada de Lck-GCaMP2 (magenta) e OER-GCaMP6f (verde). Dados foram normalizados para o valor máximo de ΔF/F0 para cada parcela. As barras cinza indicam o momento de sua aplicação. Os dados foram analisados com um software feito por TI Workbench¹⁵. Barra de escala = 50 µm (imagem microscópica).  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Espontânea de Ca^{2 +} elevação em astrócitos monitorado para expressão Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f. (A) representante hippocampal e (B) astrócitos corticais transfectados com Lck-RCaMP2 (topo) e OER-GCaMP6f (parte inferior). Células corticais foram revividas de culturas estoque congeladas. Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f imagens sequencialmente foram adquiridas na mesma cela, em 2 Hz, com uma câmera EM-CCD. As parcelas do show esquerdo ΔF/Fbase cursos de tempo medidos no ROIs indicaram na imagem microscópica. Os dados foram analisados com bancada de trabalho de TI. Filmes reais são fornecidos em vídeo 2, vídeo 3, vídeo 4e vídeo 5. Barra de escala = 20 µm (imagem microscópica). A deriva de base sugere que as alterações a nível global Ca^{2 +} na célula.  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Exemplos de Ca^{2 +} imagem nos neurônios com Lck-GCaMP6f e OER-GCaMP6f. (A) representante rato hippocampal neurônios expressando Lck-GCaMP6f no DIV 10 (à esquerda) e parcelas mostrando o tempo cursos de ΔF/F0 medidos no ROIs (círculos amarelos) tem sido indicados na imagem (à direita). Os números no curso de tempo correspondem aos números ROI na imagem. Note que o padrão temporal de elevação de Ca^{2 +} é diferente entre as várias regiões de interesse. A deriva de base sugere o aumento do Ca^{2 +} nível global neste neurônio. (B) um exemplo de neurônios hippocampal rato maduro (DIV 30) infectados com vetores AAV expressão OER-GCaMP6f (à esquerda). O tempo trama do curso de ΔF/F0 medidos mostra a Ca^{2 +} resposta a 100 µM (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) aplicado na hora mostrada pela barra cinza. Círculos amarelos mostram a posição de ROIs, onde obteve-se o curso do tempo. As imagens foram adquiridas em 2 Hz com uma câmara de refrigeração-CCD (painel A) ou uma câmera CCD EM (painel B) e analisadas com bancada de trabalho de TI. Barra de escala = 20 µm (imagem microscópica). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Video 1: exemplo de imagem simultânea de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f em células HeLa. Gravação de representante adquiriu a 10 Hz e apresentado na Figura 3. Barra de escala = 50 µm.  Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Transiente de espontânea de Ca^{2 +} observada em Lck-RCaMP2 em astrocyte hippocampal. Gravação representante adquiriu a 2 Hz (Figura 4A), gravado no mesmo campo de visão como vídeo 3. Barra de escala = 20 µm. por favor clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Transiente de espontânea de Ca^{2 +} observada em OER-GCaMP6f em um astrocyte hippocampal. Gravação representante adquirida a 2 Hz (Figura 4A), no mesmo campo de visão como vídeo 2. Barra de escala = 20 µm. por favor clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 4: Transiente de espontânea de Ca^{2 +} observada em Lck-RCaMP2 em um astrocyte cortical representante gravação adquiriu a 2 Hz (Figura 4B), gravado no mesmo campo de visão como Video 5. Barra de escala = 20 µm. por favor clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 5: Transiente de espontânea de Ca^{2 +} observada em OER-GCaMP6f em um astrocyte cortical. Gravação representante adquirida a 2 Hz (Figura 4B), no mesmo campo de visão como Video 4. Barra de escala = 20 µm. por favor clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 6: Exemplo de Ca^{2 +} imagem em um neurônio hippocampal rato (DIV 10) pela Lck-GCaMP6f. Exemplo de neuronal Ca^{2 +} sinais gravados em 2 Hz (Figura 5A). Barra de escala = 20 µm. por favor clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 7: Ca^{2 +} lançamento em um neurônio hippocampal do rato (DIV 30) expressando OER-GCaMP6f. Exemplo de Ca^{2 +} sinais neurológicos gravado em um neurônio hippocampal do rato infectado com vetores AAV OER-GCaMP6f expressão (Figura 5B). O neurônio foi estimulado com 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) aplicado em 30 s para evocar Ca^{2 +} lançamento da emergência. Barra de escala = 20 µm. por favor clique aqui para baixar este vídeo.

Discussion

Diversas saídas biológicas são iniciadas por Ca^{2 +} sinais. CA^{2 +} é um mensageiro de sinalização intracelular versátil. Decodificação de Ca^{2 +} sinais para evocar saídas específicas tem sido uma questão biológica fundamental, e Ca^{2 +} técnicas de imagem para descrever a diversidade de Ca^{2 +} sinais são necessárias. O protocolo atualmente detalhado permite a detecção de Ca^{2 +} sinais distintos na membrana plasmática e ER (Figura 3 e Figura 4) e Ca^{2 +} microdomains local dentro de uma célula (Figura 4 e Figura 5). Isto contribui para descrever a diversidade de Ca^{2 +} sinais intracelulares. A resolução temporal de Ca^{2 +} sinaliza também foi melhorado pela segmentação GECIs na membrana plasmática e ER porque pode evitar o efeito de uma difusão tridimensional do Ca^{2 +} e GECIs próprios, e tem o potencial para detectar o momento do influxo de Ca^{2 +} ou Ca^{2 +} lançamento, que ocorre na membrana.

O protocolo tem algumas limitações. Os usuários devem ter em mente que os sinais detectados são o somatório do "momento de influxo de Ca^{2 +} ou release" e "Ca^{2 +} difusa para fora da fonte original de Ca^{2 +"} , especialmente para grandes Ca^{2 +} sinais. Por exemplo, embora sua estimulação em células HeLa evoca Ca^{2 +} versão do PS, sua resultante Ca^{2 +} sinais são detectados, não só pela OER-GCaMP6f ER-alvo, mas também por plasma-membrana-alvo Lck-RCaMP2 (Figura 3). Outra limitação é que o padrão spatiotemporal de Ca^{2 +} sinais pode não ser o único determinante da saída de Ca^{2 +} sinais. A distribuição das proteínas efetoras a jusante (tais como Ca^{2 +}-dependentes quinases e fosfatases) pode também ser uma determinação do fator². Para decodificar completamente os sinais intracelulares de Ca^{2 +} , análise do comportamento da enzima a jusante, não abrangida no presente protocolo, é absolutamente necessário.

Um dos aspectos mais críticos para a bem sucedida Ca^{2 +} imagem latente é a aquisição de imagens de instalação e imagem condições, bem como para outros estudos de imagem ao vivo. Mostramos anteriormente que Ca^{2 +} respostas na célula são altamente dependentes da duração e intensidade da excitação e sobre as condições de aquisição de imagem, incluindo a exposição tempo e aquisição de frequência¹⁶. Poder da iluminação da excitação é o fator mais crítico, pois pode causar toxicidade leve e fotobranqueamento do GECIs. As condições de gravação de tempo de exposição, frequência, intensidade de luz de excitação e duração da gravação de gravação devem ser otimizadas de acordo com a finalidade do experimento. Recomenda-se reduzir o tempo de exposição e a intensidade de luz de excitação tanto quanto possível para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade à célula. A frequência de gravação e a duração da gravação devem ser suficientes para cobrir os Ca^{2 +} elevação eventos de interesse, mas devem ser mantidas tão baixas quanto possível para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade também. Recomendamos que determinar a frequência de gravação e a duração primeiro e otimizando a intensidade da luz e o tempo de exposição para que o fotobranqueamento dos GECIs é minimizado. Outro fator importante é o nível de expressão dos GECIs. GECIs tem um Ca^{2 +}-buffer efeito como eles estão Ca^{2 +}-proteínas de ligação. Portanto, a superexpressão do GECIs resultados no buffer de Ca^{2 +}, que é fisiologicamente necessário para as células. A quantidade de expressão Lino deve ser minimizada para evitar imagem células expressando quantidades elevadas de GECIs.
 
Em conclusão, a dissecação de Ca^{2 +} sinais em uma resolução subcellular é um dos mais importantes passos para descodificando Ca^{2 +} sinais intracelulares que determinam o fenômeno biológico de saída. Este protocolo fornece um novo método para a dissecação de Ca^{2 +} sinais para descrever a diversidade entre esses sinais. Atualmente, esta técnica é limitada para experimentos in vitro. No entanto, Lck-GCaMP6f já está sendo usado para a vivo em Ca^{2 +} imagem latente em ratos¹⁷e OER-GCaMP6f foi confirmado monitorar Ca^{2 +} sinais em in vivo, os neurônios motores VD em c. elegans7. Portanto, visando GECIs no compartimento subcelular tem potencial para ser expandido para in vivo de imagem no futuro, assim permitindo Ca^{2 +} dissecação em vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)	Tocris	#0342
0.5% DNase I stock solution	Sigma-Aldrich	#11284932001	Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution  supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30 °C.
0.5% Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher Scientific	#25300054
100 mM L-glutamine (×100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#25030081	Preparing small aliquots of 250-750 µL and store at -30 °C.
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#11360070	Aliquots (10 mL) can be stored at -20 °C. After thawing, the solution can be maintained at 4 °C for 2 months.
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid	Falcon	#353043	Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.
18 mm diameter circular coverslips	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Thickness 1, 18 mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	#15630080	pH 7.2-7.6
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock)	Sigma-Aldrich	#T4674	Prepare 150 µL aliquot and store at -30 °C.
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution	Sigma-Aldrich	#P3143	Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30 °C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.
70% Ethanol			Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter			AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and  pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.
B-27 supplement (×50 stock)	Thermo Fisher Scientific	#17504044	This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).
B57BL/6	Japan SLC, Inc.
Camera for microscopic image recording			The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,  ImagEM; Andor, iXon) or  CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Cell freezing container	Sarstedt K.K.	#95.64.253	Alternative cell freezing container can be used.
Cell strainer	Falcon	#352350
CO2 incubator			Maintain at 37 °C, 5% CO2.
Cryogenic tube	Corning	#430661	Alternative cryogenic tubes can be used.
Cryopreservation medium	Zenoaq		"CELLBANKER1"
Culture medium (for HeLa cells)			Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 U/mL and Streptomycin 100 µg/mL)
Dissection medium			One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM
DMEM	Nacalai	#08456-65	Alternative DMEM can be used.
DMEM	Nacalai	#08456-65	Low glucose
DNA transfection reagent	Sigma-Aldrich	#6366244001	"X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used.
Glass jar with a lid			500 mL jar (for mouse) or 1,500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal
HBSS	Thermo Fisher Scientific	#14170161	HBSS free of calcium and magnesium
Heat inactivated bovine serum	Thermo Fisher Scientific	#10100147
HeLa cells	RIKEN BioResource Center	#RCB0007
Histamine	Sigma-Aldrich	#H7125
Image analysis software			Such as Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH), and TI Workbench14 (custom made)
Image splitting optics	Hamamatsu Photonics	#A12801-01	W-view GEMINI
Image splitting optics dichroic mirror	Semrock	#FF560-FDi01-25×36	For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein  (GFP/RFP) signal
Image splitting optics emission filters	Semrock	#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25	For emission of GFP/RFP signal, respectively
Imaging medium and buffer			Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.
Incubation saline			Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS
Inverted fluorescence microscope			Such as IX73 (Olympus) or  Eclipse TI (Nikon Instech)
Isoflurane	Pfizer		Used for anesthesia
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes)			48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution.
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes)			12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution.
MEM (Minimum Essential Medium)	Thermo Fisher Scientific	#11090-081
Microscope filter set for GCaMP6f imaging			Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm)
Microscope filter set for RCaMP2 imaging			Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass)
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f	Semrock	#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25	Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.
Microscope heating system			A heating system to maintain cells at 37 °C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.
Microscope light source for excitation			Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.
Microscope objective lens			Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.
Neurobasal plus medium	Thermo Fisher Scientific	#A3582901
Neurobasal-A Medium	Thermo Fisher Scientific	#10888022	Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+	Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation	#164-23551	The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.
PC and image acquisition software			Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.
Penicillin-Streptomycin solution	Thermo Fisher Scientific	#15140122	Penicillin 10,000 U/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9			Available upon request
Plating medium (for 4 × 12 well dishes)			48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 U/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of  the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.
Recording chamber	Elveflow	Ludin Chamber	This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.
Reduced serum media	Thermo Fisher	#11058021	Opti-MEM
Stereomicroscope			Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.
Surgical instruments			Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13 cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,  3 forceps with fine tips  (Dumont Inox #5)
Transfection reagent for neuron	Thermo Fisher Scientific	#L3000008	"Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4.
Trypan blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	#15250061
Wash medium for frozen cortical cells			25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin.
Wistar rats	Japan SLC, Inc		Pregnant rats (E18)