無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング
1Department of Genetics and Metabolism,Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute,The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology,The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology,Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd
Summary
ここでは、短い所要時間、低コスト、高スループットの利点を有する、異性化症(PGT-A)の移植前遺伝子検査用半導体シーケンシング法を紹介する。
Abstract
染色体異性体は、胚発生停止、移植不全、または妊娠喪失につながる主な原因の1つであり、ヒト胚において十分に文書化されている。移植前遺伝子検査(PGT-A)は、胚の染色体異常を検出することによって生殖結果を有意に改善する遺伝子検査である。次世代シーケンシング(NGS)は、遺伝子解析のための高スループットと費用対効果の高いアプローチを提供し、PGT-Aの臨床的応用性を示しています。ここでは、胚における無気不変のスクリーニングのための迅速かつ低コストの半導体シーケンシングベースのNGS法を提示する。ワークフローの最初のステップは、生検胚標本の全ゲノム増幅(WGA)、続いてシーケンシングライブラリの構築、および半導体シーケンシングシステム上のシーケンシングです。一般に、PGT-A アプリケーションの場合、各チップに 24 個のサンプルをロードし、150 塩基対の平均読み取り長で 60-8000 万の読み取りを生成します。この方法は、テンプレートの増幅とシーケンシング ライブラリの強化を行うための洗練されたプロトコルを提供し、PGT-A検出を再現可能、高スループット、コスト効率、および時間節約にします。この半導体シーケンサーの稼働時間はわずか2~4時間で、サンプルの受け取りからレポートの発行までの所要時間を5日間に短縮します。これらすべての利点は、このアッセイを胚から染色体異性体を検出し、したがって、PGT-Aでの広い適用を容易にする理想的な方法を作る。
Introduction
補助生殖における転移のための正常な染色体コピー番号(ユーロイド)を持つ良好な生存胚を選択することは、妊娠の結果を改善するのに役立ちます。伝統的に、確立された形態グレーディングシステムは、その容易な可用性と非侵襲的な性質のために胚の評価のために広く使用されています。しかし、形態学的評価は、胚の質1および移植電位2に関する限られた情報しか提供できることが示されている。根本的な理由の一つは、胚の染色体組成を評価できないことである。
染色体異性体(染色体の異常コピー数)は、胚発生停止、移植不全または妊娠喪失につながる主な原因の一つである。無気腫の発生はヒト胚において十分に文書化されており、胚盤胞5では切断段階胚3、4および50%−60%で60%−70%を占めている。これは、ある程度、体外受精(IVF)治療の妊娠率の改善におけるボトルネックに寄与しており、これは約35%−40%6、7で維持されている。したがって、移植のためのユーロイド胚を選択することは、妊娠の結果を改善するために有益であると考えられている。この目的のために、移植前遺伝子検査(PGT-A)は、遺伝的アプローチを用いて胚の生存率を調べるためにさらに開発された。PGT-Aの重要な役割をサポートする無作為化対照試験およびコホート研究の数が増加している。PGT-Aの適用は流産率を減少させ、臨床妊娠率および移植率8、進行中の妊娠率および出生率9を増加させることを証明した。
歴史的に、PGT-Aには、その場所ハイブリダイゼーション(FISH)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、アレイ-CGH、単一ヌクレオチド多型(SNP)マイクロアレイなどの異なる方法が適用されてきました。これまでの研究では、FISHによる切断段階胚に対するPGT-Aは、59273array-CGHまたは59273array-CGHを用いた対応する胚盤胞の包括的な染色体スクリーニング(CCS)によって得られたものと一致しない結果を得るSNP-マイクロアレイ5927310.これらの不一致は、染色体モザイク、FISH技術アーティファクト、または開発11の間に染色体分離エラーの胚自己補正に起因しうる。アレイCGHやSNPマイクロアレイなどのアレイベースのPGT-Aに胚盤胞性栄養細胞(TE)生検を用いることは、胚10、12における染色体不均衡の同定に有効であると広く認識されている。近年、単細胞次世代シーケンシング(NGS)は、遺伝子解析のための高スループットと費用対効果の高いアプローチを提供し、PGT-A 13,14,15の臨床的応用性を示しています。現在利用可能な方法に代わる有望な方法です。
ここでは、ヒト胚における無気球体のスクリーニングのための高速、堅牢、低コストの半導体シーケンシングベースのNGS法を提示する。ワークフローの最初のステップは、生検胚標本の全ゲノム増幅(WGA)であり、単一細胞WGAキットを使用して、シーケンシングライブラリの構築、および半導体シーケンシングシステム上でのその後のシーケンシングを行います。
DNA鎖合成時に各デオキシリボヌクレオシド三リン酸から放出されるH+イオンを検出することにより、半導体元素によって捕捉された化学信号(pH変化)を転送し、デジタルデータを導くDNA配列情報にさらに解釈されます。高価な光学検出および複雑なシーケンシング反応のための条件を除去し、この簡単なシーケンシング化学は総試薬の費用を削減し、2-4時間16にシーケンシングの実行時間を短縮する。さらに重要なのは、製造元のパフォーマンス仕様に基づいて、半導体シーケンシングプラットフォームは、実行あたり最大15 GBのシーケンスデータ(ライブラリの品質に依存)を生成でき、他のシーケンサーよりも大幅に高い約 3−4 GBのデータ(2 x 75 bpの読み取り長)17を生成します。PGT-Aの臨床応用では、このプラットフォームは、最大8,000万回の読み取り17回、各サンプルの少なくとも100万回のユニークな読み取り値を生成するチップあたり24サンプルを達成することができます。読み取り深さは各サンプルが少なくとも0.05x全体のゲノムカバレッジを有することを保障できる。このプラットフォームの上記の利点は、理想的なスクリーニング方法を作り、したがって、PGT-A18でその広いアプリケーションを容易にします。
Protocol
香港合同中国大学-新地域東部クラスター臨床研究倫理委員会(参考文献:2010.432)により倫理的承認を受けました。研究ライセンスは、香港の人間生殖技術評議会(番号R3004)によって承認されました。 1. 全ゲノム増幅 開始前に、磁気ビーズ(材料の表)の体積を確認して、各サンプルに135μL(20%の過剰)がないことを確認してください。磁気ビーズを室温(RT)で?…
Representative Results
この改変プロトコルに基づき、半導体シーケンシングプラットフォームは初めてPGT-Aに適用されました。切断段階の胚盤胞と胚盤胞期胚の両方からの生検について試験した。生検細胞は、DNAの分解を防ぐために、できるだけ早くWGAを受けることが示唆される。以前の研究では、異なるWGAメソッドの性能を比較し、ここで説明した方法は、100 KB20のビン…
Discussion
他のシーケンシング化学品とは異なり、ここで説明するシーケンサーは、ヌクレオチドの検出に半導体を使用します。チップ自体は、ポリメラーゼ駆動ベース組み込み17により水素イオンを検出する電子デバイスであり、プロトンプログラムの2〜4時間シーケンシング時間を可能にする。また、このチップは、他のシーケンサープロバイダーによるフローセルシーケンシング…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、広西省科学技術財団の主要研究計画である中国国家自然科学財団(Ref No.81860272)である香港の一般研究基金(Ref No.14162417)の支援を受けた。AB16380219)、および中国から中国ポストドクター科学財団助成金(Ref No. 2018M630993)。
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
Referencias
- Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
- Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
- Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
- Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
- Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
- Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
- Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
- Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
- Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
- Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
- Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
- Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
- Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
- Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
- Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).
- Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).
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Citar este artículo
Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, Y. K. Y., Lui, W. T., Yeung, Q. S. Y., Kong, L., Xuan, L., Chung, J. P. W., Choy, K. W. Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy. J. Vis. Exp. (150), e59273, doi:10.3791/59273 (2019).