ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים
Summary
פרוטוקול זה מתאר מבע ו אורתובנושא מודלים העכבר של בלוטת התריס האנושית tumorigenesis כפלטפורמה לבדוק טיפולים מעכבי מבוססי-אורנה. גישה זו אידיאלית כדי ללמוד את הפונקציה של RNAs ללא קידוד והפוטנציאל שלהם כמטרות טיפוליות חדשות.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) הם הרגולטורים חשובים של ביטוי גנים דרך היכולת שלהם לערער את היציבות mRNA ולעכב את התרגום של Mrna היעד. מספר גדל והולך של מחקרים זיהו miRNAs כסמנים פוטנציאליים לאבחון סרטן פרוגנוזה, וגם כמו מטרות טיפוליות, הוספת ממד נוסף להערכת סרטן וטיפול. בהקשר של סרטן בלוטת התריס, התוצאות tuמוריגנזה לא רק מוטציות בגנים חשובים, אלא גם מהבעת היתר של miRNAs רבים. בהתאם, התפקיד של miRNAs בשליטה של ביטוי גנים בלוטת התריס מתפתחת כמנגנון חשוב בסרטן. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את ההשפעות של משלוח miRNA-מעכבי כמו מודאליות טיפולית בסרטן בלוטת התריס באמצעות השתלת הגידול האנושי מודלים אורתוקפית העכבר. לאחר בלוטת התריס יציבה הנדסה מוסרי תאים המבטא GFP ו לluciferase, תאים מוזרק לתוך עכברים ערומים לפתח גידולים, אשר ניתן לאחר מכן ביולומינסנציה. בעיכוב vivo של miRNA יכול להפחית את צמיחת הגידול ו upregulate miRNA מטרות גנים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את חשיבותו של miRNA נחושה בvivo, בנוסף לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.
Introduction
סרטן בלוטת התריס הוא ממאירות אנדוקרינית עם שכיחות הולך וגובר, למרות במונחים כלליים יש תוצאה טובה1. עם זאת, חלק מהחולים לפתח צורות אגרסיביות של המחלה כי הם ללא טיפול ובסיסים מולקולריים הבינו בצורה עלובה2.
miRNAs הם 22-נוקלאוטיד ארוך שאינו קידוד RNAs כי לווסת ביטוי גנים ברקמות רבות, בדרך כלל על ידי כריכת זוג בסיס ל 3 ‘ אזור untranslational (3 ‘ UTR) של שליח היעד RNAs (mRNAs), הפעלה של השפלה או הדיכוי הטרנסאפילי של Mrnas מיכל שלוש , 4. יש ראיות הגוברת הוכחת כי רגולציה של הביטוי מיקרואורנה הוא סימן ההיכר של סרטן, כמו אלה מולקולות לווסת איתות מתרבים, הגירה, הפלישה גרורות, והוא יכול לספק התנגדות אפופטוזיס 5,6. בשנים האחרונות, מחקרים רבים זיהו miRNAs כמו סמנים פוטנציאליים לאבחון סרטן פרוגנוזה, כמו גם מטרות טיפוליות7, מתן ממד חדש להערכת סרטן וטיפול.
mirnas לקחו את הבמה במרכז האונקולוגיה האנושית כמו נהגים מרכזיים של האדם בלוטת התריס נחיים8,9,10,11,12. בין miRNAs מוסדר, מיר-146b הוא מבוטא מאוד בבלוטת התריס קרצינומה (PTC) גידולים והוכח באופן משמעותי להגדיל את התפשטות התא, ולהיות משויך אגרסיביות ופרוגנוזה עגומה6, מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , 15. יתר על כן, מיר-146b מסדיר מספר גנים בלוטת התריס המעורבים בבידול12, וגם גנים חשובים מדכא הגידול כגון PTEN16 ו DICER117. למרות החשיבות שלהם בביולוגיה של סרטן, miRNA מבוססי טיפול בסרטן עדיין בשלבים המוקדמים שלה, ומחקרים מעטים מאוד התייחסו לסרטן בלוטת התריס-התכופים ביותר של גידולים האנדוקרינית18. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שני דגמי העכבר השונים עם האדם הנגזר גידולים, שבו המינהל של מירנה סינתטי מעכבי (antagomiR) כי מעכב באופן ספציפי miRNA הסלולר יכול לחסום את צמיחת הגידול. השתמשנו לראשונה במודל משותף של מבע, ואת intratumor המקומי הממשל של antagomiR ירד גידול הגידול נמדד כירידה בביולומילומינציה הגידול16. בגלל הקמתה של דגמים חזקים של העכבר מחקה התקדמות הגידול האנושי חיוני כדי לפתח גישות טיפוליות ייחודי, אורתודהשרשה של גידולים אנושיים העיקרי היא פלטפורמה יקר יותר עבור אימות קליני של תרופות חדשות מאשר דגמים השרשה תת-עורית. כך, על מנת להעריך טוב יותר את הפוטנציאל התרפויטי של antagomiR, השתמשנו מודל העכבר אורתוטופית עם משלוח מערכתי בזרם הדם, קבלת תוצאות זהות.
Protocol
Representative Results
Discussion
נייר זה מתאר שיטה ללמוד בפונקציה vivo של miRNA כדי להבין טוב יותר את תפקידה בייזום הגידול והתקדמות, ואת הפוטנציאל שלה כיעד טיפולית בסרטן בלוטת התריס. מודלים מבע הגידול כאן מבוססים על השימוש בתאים שניתן מעקב על ידי האות הביולומינציה שלהם, המתיר את המדידה של גידול בגידול בvivo תחת השפעת הטיפול. בנו…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לרקל ארצ’ה ריסקו על עזרתה בטיפול ובדאגה לעכברים. אנו מודים ד ר. J. בלאנקו (המכון הקטלוני לכימיה מראש-CSIC) ו ד ר. מאטו (מכון דה Reserca de l ‘ בית החולים דה לה סנטה Creu אני סנט פאו) ברצלונה (ספרד) עבור gifting של CSIC-גחלילית לוק-IRES-EGFP ו Cal62-לוק תאים, בהתאמה.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
Referencias
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
- Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. Investigación sobre el cáncer. 65 (9), 3509-3512 (2005).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
- Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
- Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
- Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
- Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
- Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Investigación sobre el cáncer. 75 (19), 4119-4130 (2015).
- Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
- Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
- Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , (2019).
- Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).
