Biossíntese de um flavonol de um Flavanone estabelecendo uma cascata Bienzimática de um pote
Summary
A derivação de um flavonol é crucial para sua aplicação na saúde e na indústria alimentícia. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a biossíntese de um flavonol de um flavanone e discutimos as etapas cruciais e suas vantagens sobre outras aproximações.
Abstract
Os flavonóis são uma subclasse importante de flavonoides com uma variedade de atividades biológicas e farmacológicas. Aqui, nós fornecemos um método para a síntese enzimática in vitro de um flavonol. Neste método, Atf3h e Atfls1, dois genes chave na via biossintética dos flavonóis, são clonados e superexpressos em Escherichia coli. As enzimas recombinantes são purificadas através de uma coluna de afinidade e, em seguida, uma cascata bienzimática é estabelecida em um tampão sintético específico. Dois flavonóis são sintetizados neste sistema como exemplos e determinados pelas análises de TLC e HPLC/LC/MS. O método exibe vantagens óbvias na derivação de flavonóis sobre outras abordagens. É tempo e trabalho de poupança e altamente rentável. A reação é fácil de ser controlada com precisão e, assim, escalada para a produção em massa. O produto-alvo pode ser facilmente purificado devido aos componentes simples do sistema. No entanto, este sistema é geralmente restrito à produção de um flavonol de um flavanone.
Introduction
Os flavonóis são uma subclasse importante de flavonoides vegetais e estão envolvidos no desenvolvimento de plantas e na pigmentação1,2,3. Mais importante, estes compostos possuem uma ampla gama de atividades benéficas para a saúde, tais como anti-câncer4,5, anti-oxidativo6, anti-inflamatória7, antiobesidade8, anti-hipertensivo9 e as propriedades de recuperação de memória10, levando a um grande número de estudos sobre esses metabólitos secundários derivados da planta. Tradicionalmente, esses compostos são derivados principalmente da extração vegetal usando solventes orgânicos. No entanto, devido ao seu conteúdo muito baixo nas plantas11,12,13, o custo de produção para a maioria dos flavonóis permanece elevado, o que impõe grandes restrições à sua aplicação nos cuidados de saúde e os alimentos Indústria.
Durante as últimas décadas, os cientistas desenvolveram um grande número de métodos para derivar flavonoides14,15. Entretanto, a síntese química destas moléculas complicadas possui uma variedade de desvantagens intrínsecas16. Exige não somente reagentes tóxicos e condições extremas da reação, mas igualmente muitas etapas para produzir um composto do flavonóide do alvo14,17. Além disso, outro importante desafio nessa estratégia é a síntese quiral de moléculas ativas de flavonoides. Portanto, não é uma estratégia ideal para produzir flavonoides em escala comercial através da síntese química16,17.
Recentemente, os cientistas desenvolveram uma estratégia alternativa prometedora para produzir estes compostos naturais complicados por micróbios da engenharia com um caminho para a biossíntese flavonóide18,19,20, 21 anos de , 22, que foi decifrado com sucesso nas plantas23. Por exemplo, Duan et al. introduziram uma via biossintética na levedura brotamento Saccharomyces cerevisiae para produzir kaempferol (KMF)24. Malla et al. produziram astragalin, um flavonol glicosilado, introduzindoflavanona 3-hidroxilase (f3h), flavonol sintase (FLS1) e UDP-glicose: Flavonoide 3-O-glucosiltransferase UGT78K1 genes em Escherichia coliBL21 (de3)17. Mesmo que existam alguns paradigmas, nem todos os micróbios geneticamente modificados produzem os produtos de interesse devido à complexidade de uma plataforma celular, à incompatibilidade entre elementos genéticos e hospedeiros artificialmente sintetizados, o inibidor efeito de produtos-alvo contra células hospedeiras, e a instabilidade de um sistema celular projetado em si16.
Outra estratégia alternativa promissora para a produção de flavonoides é estabelecer uma cascata multienzimática in vitro. Cheng et al. relataram que as poliketides enterocina podem ser sintetizadas com sucesso através da montagem de uma via enzimática completa em um pote25. Esta estratégia sintética livre de células contorna as restrições de uma fábrica de produção microbiana e, portanto, é viável para a produção de alguns flavonoides em grande quantidade16.
Recentemente, nós desenvolvemos com sucesso um sistema sintético do bienzyme para converter naringenina (NRN) em KMF em um potenciômetro16. Aqui, descrevemos este sistema em grandes detalhes e os métodos envolvidos na análise dos produtos. Também apresentamos dois exemplos que utilizam este sistema para produzir KMF de NRN e quercetina (QRC) de eriodictyol (ERD). Além disso, discutimos etapas cruciais deste método e futuras direções de pesquisa na biossíntese de flavonoides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um grande número de estudos são focados na derivação de flavonóis devido à sua potencial aplicação na saúde e na indústria alimentar. No entanto, a extração tradicional de plantas utilizando solventes orgânicos e síntese química possui desvantagens intrínsecas, que restringem seu uso na produção de flavonóis. Aqui, nós relatamos um método detalhado para produzir um flavonol de um flavanone em um potenciômetro estabelecendo uma cascata bienzimática in vitro. As etapas críticas neste protocolo são:…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Universidade Yangzhou especialmente nomeado professor start-up fundos, Jiangsu especialmente nomeado professor start-up fundos, seis Talent Peaks projeto na província de Jiangsu (Grant no. 2014-SWYY-016), e um projeto financiado por o desenvolvimento do programa acadêmico prioritário das instituições de ensino superior de Jiangsu (medicina veterinária). Agradecemos ao centro de testes da Universidade Yangzhou para análises de HPLC e MS de flavonoides.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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