iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン
Summary
誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。
Abstract
誘導多能性幹細胞(iPSC)は、任意の体細胞型に分化することができる患者特異的、増殖性細胞源である。二能性内皮前駆体(EP)は、成熟した機能的血管系を組み立てるのに必要な細胞タイプに分化することができ、胚性および誘導多能性幹細胞の両方から得られている。しかし、これらの細胞は3次元環境では厳密に評価されておらず、血管球電位の定量的尺度は依然として解明されていない。ここでは、蛍光活性化細胞選別によるiPSC-EPの生成と単離について最初に概説し、続いてコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化および培養の説明を行う。この細胞外マトリックス(ECM)模倣微小環境は、堅牢な血管学的応答を奨励する。血管ネットワークは、培養の1週間後に形成されます。オープンソースソフトウェアを利用してこの血管学的応答を定量化する計算パイプラインの作成を示す。このパイプラインは、キャピラリープレクサスの 3D アーキテクチャを維持し、ブランチの数、分岐ポイント、およびユーザー入力を最小限に抑えてネットワークの総長を堅牢に識別するように特別に設計されています。
Introduction
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)および他の一次内皮細胞型は、インビトロ1における血管の発芽および発達をモデル化するために20年間利用されてきた。このような血管プラットフォームは、心血管疾患の分子および組織レベルのメカニズムを照らすことを約束し、原始的な血管ネットワーク2,3の発達に生理学的洞察を提示しうる。血管モデリングの分野は大きな進歩を遂げましたが、生理学的血管の発達を定量的にモデル化し評価できる「ゴールドスタンダード」アッセイは依然として解明されていません。ほとんどの公表されたプロトコルは、成熟した機能的な血管の形成を奨励するために血管ニッチを十分に要約しないか、評価された細胞型の血管球電位を3次元で定量的に比較する方法を持っていない(3D)。
多くの現在の血管モデルは、生理血管ニッチを模倣する能力に制限されています。インビトロプラットフォームで最も一般的に採用されているのは、ゼラチン性タンパク質混合物系チューブ形成アッセイです。簡単に言えば、HUVECは、マウス肉腫細胞外マトリックス(ECM)から採取されたタンパク質からなるゲルの薄い層上の単一細胞として播種される。1〜2日以内に、HUVECは原始的な管4に自己集合する。しかしながら、このプロセスは、このアッセイで利用される2次元(2D)および内皮細胞(IC)が密閉された中空の内包を形成せず、それによってこれらの研究の生理的意義を制限する。さらに最近では、ICおよび支持細胞(例えば、間葉系幹細胞(MSC)およびペリサイト)は、コラーゲンまたはフィブリンヒドロゲル5などの天然ECMの繊維構造をシミュレートする3D微小環境で共培養されている。この微小環境における血管発達をモデル化するために、ICでコーティングされたポリマービーズは、典型的には6を採用している。ヒドロゲルに間に埋め込まれた他の細胞によって分泌される外因性成長因子および/または成長因子の添加は、ICを誘導し、ポリマービーズをコーティングし、単一の内気を発芽させ、形成することができる。その後、芽や血管の数と直径を計算することができます。しかし、これらの芽は特異であり、生理学的条件で見られるように密閉された接続されたネットワークを形成しないため、腫瘍血管系モデルを連想させる。マイクロ流体デバイスはまた、血管ニッチを模倣し、ECを含むヒドロゲル7、8における血管系の形成を促進するために利用されている。典型的には、血管新生成長因子勾配は、EC移行および発芽を誘導するために循環細胞培養培地に適用される。発達した血管の内気を構成するICは、マイクロ流体装置を通る流体の流れの適用によって引き起こされるせん断応力に敏感である。したがって、これらのマイクロ流体デバイスは、静的モデルではアクセスできない主要な生理学的パラメータを捕捉します。しかし、これらのデバイスには高価な微細加工能力が必要です。
最も重要なことは、3つの血管モデル(2D、3D、マイクロ流体)すべてが、一次ICと一次支持細胞タイプを圧倒的に利用していることです。一次細胞は、移植時に免疫応答を生じるので、効果的な心血管療法に開発することはできません。さらに、HUVECおよび同様の一次細胞型は患者特異的ではなく、遺伝的性質または既存の健康状態(例えば糖尿病)を有する患者に生じる血管異常を捕捉しない。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、患者特異的で増殖性の細胞源として過去10年間に出現しており、人体内のすべての体細胞に分化することができる9。特に、iPSC由来の内皮前駆子(iPSC-EPs)10,11の生成と単離を概説するプロトコルが公開されている。iPSC-EPは二重能であり、したがって、成熟した機能的血管系のビルディングブロックである内皮細胞および平滑筋細胞/ペリサイトにさらに分化することができる。3D微小環境12におけるiPSC-EPからの一次毛細叢の開発を説得力のある詳細に述べた研究は1つだけだ。本研究は、iPSC-EPアセンブリの理解と天然および合成ヒドロゲルの分化にとって重要であるが、得られた血管系のネットワークトポロジを定量的に比較しなかった。別の最近の研究では、ポリマービーズモデルを使用して、HUVECとiPSC由来のIC5の発芽を比較しました。したがって、3D微小環境におけるiPSC-EP血管形成を調節する物理的および化学的シグナル伝達機構をさらに解明し、これらの細胞が虚血療法および心血管疾患に適しているかどうかを判断する必要があることは明らかである。モデリング。
過去10年間で、血管ネットワークの長さと接続性を定量化し、比較するために、さまざまなオープンソースの計算パイプラインとスケルトン化アルゴリズムが開発されました。例えば、Charwatらは、フィブリンマトリックス13,14における脂肪由来幹細胞と成長するICの共培養に由来する血管ネットワークの濾過されたバイナリ化画像を抽出するPhotoshopベースのパイプラインを開発した。おそらく、最も広く使用されているトポロジ比較ツールは、AngioTool、国立がん研究所15によってオンラインで公開されたプログラムです。プログラムの広範な採用と十分に文書化された忠実さにもかかわらず、プログラムは2次元で血管のような構造を分析し、AngioSysとWimasisを含む他のプログラムは、同じ次元制限16を共有しています。イマリス、ルシス、メタモルフなどの強力なソフトウェアスイートは、設計された微小血管のネットワークトポロジを分析するために開発されました。ただし、これらのスイートは、ほとんどのアカデミック ラボにとってコストがかかり、ソース コードへのアクセスを制限する必要があるため、エンド ユーザーが特定のアプリケーションに合わせてアルゴリズムをカスタマイズする機能を妨げる可能性があります。オープンソースの磁気共鳴イメージング/コンピュータ断層撮影パッケージである3Dスライサーには、3D血管ネットワークのトポロジを効果的に分析できる血管モデリングツールキットが含まれています17;ただし、分析はユーザーがネットワークのエンドポイントを手動で配置することに依存します。この原稿では、3D血管ネットワークを定量することができる計算パイプラインについて詳しく説明する。上記の制限を克服するために、このオープンソースの計算パイプラインは、ImageJを使用して取得した共焦点イメージを事前に処理し、3D ボリュームをスケルトンアナライザにロードします。スケルトンアナライザは、並列中間軸間引きアルゴリズムを使用し、もともとKerschnitzkiらによって開発され、骨細胞ネットワーク18の長さと接続性を分析しました。このアルゴリズムは、設計された微小血管の長さと接続性を特徴付けるために効果的に適用することができる。
全体として、このプロトコルは、3Dマイクロ環境における微小血管ネットワークの作成の概要を説明し、オープンソースとユーザバイアスの自由な計算パイプラインを提供し、iPSC-EPの血管学的可能性を容易に比較します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、E8、LaSR基底、およびEGM-2の3種類の細胞培養培地における細胞の長期培養を含む。したがって、すべての材料を適切に殺菌するために細分注意する必要があります。さらに、ラボコートとエタノール洗浄手袋は、実験室の層流フードで作業する場合は常に着用する必要があります。マイコプラズマ汚染を頻繁にテストすることをお勧めします。iPSC培養中に大量の破片が観測…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国心臓協会(助成番号15SDG25740035、J.Z.に授与)、国立衛生研究所の生物医学イメージングとバイオエンジニアリング研究所(NIBIB)(助成番号EB007507、C.C.に授与)によって支援されました。再生リハビリテーション研究・訓練同盟(AR3T、助成番号1 P2C HD086843-01、J.Z.に授与)私たちは、ジャンヌ・スタッコワック教授(テキサス大学オースティン校)が共焦点顕微鏡に関する技術的助言を受け入れたいと思います。また、サミュエル・ミヘリック(テキサス大学オースティン校)、アリシア・アレン博士(オースティンのテキサス大学)、ジュリー・リトルフスキ博士(アダプティブ・バイオテクノロジー)、レオン・ベラン博士(ヴァンダービルト大学)とのディスカッションにも感謝しています。3Dネットワークの計算分析。最後に、iPSCをiPSC-EPに分化するためのアドバイスを、カリフォルニア大学バークレー校のXiaoping Bao博士に感謝します。
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
| 96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
| Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
| CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
| Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
| Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
| Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
| Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
| Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
| Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
| Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
| VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
| Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
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