공포 대조 신경 활동의 만성 조작을 위한 비침범성 전략
Summary
여기에서 우리는 마우스에 있는 화학유전학을 사용하여 만성적으로 신경 활동을 통제하는 2개의 비침범성 방법을 기술합니다. 점안액은 클로자핀-N-산화물(CNO)을 매일 전달하는 데 사용되었습니다. 우리는 또한 식수에서 CNO의 장기간 투여를위한 두 가지 방법을 설명합니다. 만성 신경 조절을 위한 이러한 전략은 동물의 스트레스를 줄이는 최소한의 개입이 필요합니다.
Abstract
화학 유전학 전략은 신경 활동의 원격 제어를위한 신뢰할 수있는 도구로 등장했다. 이 중, 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화 디자이너 수용체 (DREADDs) 현대 신경 과학에 사용되는 가장 인기있는 화학 유전 적 접근 방식이되고있다. 대부분의 연구는 단일 복강 내 주사를 사용하여 리간드 클로자핀-N-옥사이드(CNO)를 전달하며, 이는 표적 뉴런 집단의 급성 활성화/억제에 적합합니다. 그러나, DREADD 통제된 신경의 만성 변조를 위한 전략의 단지 몇몇 보기가 있습니다, 대다수는 외과 적 개입을 요구하는 납품 시스템의 사용에 의존합니다. 여기에서, 우리는 마우스에 있는 신경 인구를 만성조작하기 위하여 리간드 CNO를 전달하기 위한 2개의 비침범성 전략에 확장합니다. CNO는 반복적인 (매일) 점안액을 사용하거나 동물의 식수를 통해 만성적으로 투여되었습니다. 이러한 비침습적 패러다임은 CNO 치료 전반에 걸쳐 지속되는 디자이너 수용체의 강력한 활성화를 초래한다. 여기서 설명된 방법은 신경 활동의 만성 DREADD 매개 제어에 대한 대안을 제공하며 덜 침습적인 CNO 전달 방법에 초점을 맞추어 자유롭게 움직이는 동물의 행동을 평가하도록 설계된 실험에 유용할 수 있습니다.
Introduction
신경 과학 분야의 기술적 진보로 인해 과학자들은 특정 신경 인구의 활동을 정확하게식별하고 제어 할 수 있었습니다 1. 이것은 신경 회로의 기초와 동물 행동에 미치는 영향을 더 잘 이해하는 데 기여했으며, 확립된 교리 2,3을개정했습니다. 이러한 새로운 도구 중, 광유전학 및 화학 유전학 전략은 발견의 품질뿐만 아니라 실험이 생각되고 설계되는 방법에뿐만 아니라 깊은 영향을 미쳤다4. 본 원고에서, 우리는 엔지니어링 수용체 -ligand 전략을 통해 뉴런의 활성화를 제어하기위한 화학 유전 적 전략에 초점을 맞추고 있습니다. 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화 디자이너 수용체 (DREADDs) 신경 활동의 원격 제어를위한 가장 인기있는 화학 유전 도구 중 하나를 나타냅니다, Roth에 의해 검토 20165. 공포는 불활성 리간드, 클로자핀-N-산화물 (CNO) 6에 의해 특별히 활성화되는 변형 된무스카린 아세틸 콜린 수용체를 이용한다.
대부분의 연구는 효과적으로 급성 방식으로 엔지니어링 된 수용체 활성화의 복용량과 타이밍을 제어 복강 내 (i.p.) 주사에 의해 투여 CNO를 사용합니다. 그러나, 반복적 또는 만성 DREADD 활성화가 필요한 경우, 다중 i.p. 주사의 사용은 불가능하게된다. 이 문제를 해결하기 위해, 만성 CNO 전달을위한 다른 전략이보고되었다, 이식 미니 펌프를 포함7 두개내 캐뉼러 8,9. 상이한 범위에서, 이들 모든 전략은 동물에게스트레스와 통증을 유발하고, 11을 시험하기 위해 행동 반응에직접적인 영향을 미칠 수 있는 외과적 개입을 요구한다. 여기에서는, 우리는 만성 CNO 납품을 위한 3개의 비침범성 전략을 기술합니다.
이를 위해, 마우스는 리간드 CNO에 의해 활성화될 때 폭발적인 발사로 이어지는 흥분성 M3 무스카린 수용체(hM3Dq)의 엔지니어링 버전을 코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 해마에 입체적으로 주입하였다. 뉴런6. 이전에는 CNO를 포함하는 단일 안약이 DREADD 발현 뉴런(12)의 강력한활성화를 효과적으로 유도할 수 있음을 보여주었다. 여기서 우리는 점안액의 반복적인 전달을 위한 수정된 방법을 기술한다. 디자이너 수용체의 만성적이고 지속적인 제어를 달성하기 위해, 우리는 다음 식수를 통해 마우스에 CNO를 제공하기 위해 비 침습적 전략을 설명합니다. 마지막으로 제한된 시간 동안 식수에 CNO를 제공하기 위한 대체 패러다임을 설명합니다. 마우스 운동 활동뿐만 아니라 음주 행동 및 달콤한 칼로리 용액의 소비는 주로 빛 / 어두운 주기(13,14)의어두운 부분으로 제한된다. 따라서, 우리는 자당에 대한 마우스의 선호도에 따라 프로토콜을 채택했다. AAV 감염 된 세포에서 즉각적인 초기 유전자 c-Fos의 유도를 측정 하 여, 신경 활성화에 대 한 판독으로12,15,우리는 이러한 CNO 전달 전략 강력 하 게 확장 이상 DREADD 제어 뉴런을 활성화 발견 기간.
Protocol
Representative Results
Discussion
공포는 원격으로 신경 활동을 조작하는 대중적이고 효과적인 접근법으로 등장했다17. CNO 제공을 위한 대체 전략설계는 특정 실험 설정에 사용할 수 있는 옵션의 스펙트럼을 광범위하게 증가시킬 것입니다. 또한, CNO의 전달을 위한 비침습적 전략은 동물의 건강에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 부작용을 감소시킴으로써 결과의 잠재적인 오해를 최소화합니다. 여기에서는 DREADDs(hM…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 정신 건강의 국립 연구소에서 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다 (ZIA MH002964-02). 우리는 NIMH IRP 설치류 행동 코어 (ZIC MH002952)의 지원에 감사드립니다.
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
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