非酒精性脂肪性肝炎合并2型糖尿病的一种先进的小鼠模型
Summary
描述了一种简单可靠的饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 啮齿类动物模型, 通过动物的非 spf 外壳和特定高脂肪饮食的管理实现。我们描述了肝脏和脂肪免疫细胞亚群的鉴定, 通过使小鼠接触环境细菌来重述人类的免疫状况。
Abstract
肥胖与慢性低度炎症和胰岛素抵抗相关, 导致慢性代谢疾病 (如2型糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 发病率不断上升。最近的研究已经证实, 促炎性免疫细胞浸润肥胖肥厚脂肪组织和肝脏。鉴于免疫细胞在代谢稳态方面的重要性正在显现, 在2型糖尿病和 NASH 的发展过程中, 迫切需要量化和描述免疫细胞的修饰。然而, 诱导人类纳什典型的病理生理特征的动物模型却很少。
在本文中, 我们提供了一个详细的协议, 以识别从肝脏和脂肪组织分离出的免疫细胞亚群在一个可靠的小鼠模型的 NASH, 建立通过住房高脂肪饮食 (HFD) 小鼠在非特定病原 (SPF) 条件下没有障碍至少七个星期。我们演示了小鼠在非 spf 条件下的处理, 组织的消化和巨噬细胞的鉴定, 自然杀伤细胞, 树突状细胞, B 和 T 细胞子群流式细胞仪。提供了来自 SPF HFD 小鼠和非 spf 小鼠的代表性流式细胞仪图。为了获得可靠和可解释的数据, 使用抗体、准确和精确的组织消化方法以及流式细胞术中的适当门控是关键要素。
通过将小鼠安置在非 spf 条件下和不特异性接触微生物抗原来恢复其生理抗原暴露的干预措施, 可以为调查饮食诱导的免疫改变之间的联系提供相关的工具肥胖和相关的长期并发症。
Introduction
肥胖是一种多因素疾病, 也是患心脏病、中风、非酒精性脂肪性肝炎 (nash)、2型糖尿病 (T2D) 和某些类型癌症的主要危险因素。全球肥胖流行率正在迅速上升。如今, 21亿人–占世界人口的近30%–要么肥胖, 要么超重1人。与肥胖相关的胰岛素抵抗可导致 T2D, 当耗尽的胰岛β细胞不能补偿胰岛素维持葡萄糖稳态的需求增加2。
脂肪组织由不同类型的细胞组成, 包括脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。在肥胖的过程中, 免疫细胞数量和活性的变化会导致肥厚性脂肪组织的低度炎症 3,4。具体而言, 人们发现, 过量的能量摄入, 伴随着血糖、甘油三酯和游离脂肪酸水平的长期升高, 会导致脂肪细胞缺氧、内质网应力、线粒体功能受损和增强细胞因子分泌, 导致促炎脂肪免疫细胞激活 5,6。过去的研究主要集中在先天免疫上, 但最近自适应免疫细胞 (T 和 B 细胞) 已成为葡萄糖稳态的重要调节剂。它们具有炎症 (包括 cd8+ t 细胞、th1 和 b 细胞) 或主要的调节功能 (包括调节 t (treg) 细胞、th2 细胞), 既能加剧或抵御胰岛素抵抗7,8,9个。
此外, 还提出了几种机制来解释肥胖如何增加脂肪性肝炎, 包括脂肪组织10产生的细胞因子.NASH 是非酒精性脂肪性肝病的进步形式, 也是发达国家的主要健康负担, 其组织学特征是肝细胞膨胀、脂质积累、纤维化和周细胞炎症, 并可能发展到肝硬化、终末期肝病或肝细胞癌。已知有几种方案 (例如蛋氨酸和胆碱缺乏饮食)可诱导非人类动物模型中的 nash 样肝病理学, 但这些方法大多不能重述 nash 的人类状况及其代谢后果, 因为他们要么需要特定的基因敲除, 非生理饮食操纵或缺乏胰岛素抵抗典型的人类 NASH。此外, 我们对代谢疾病潜在机制的理解目前是基于对在标准特定无病原体 (SPF) 条件下的实验室小鼠进行的实验。这些屏障设施异常卫生, 不考虑人类必须遇到的微生物多样性, 这可能是动物研究翻译到 12、13 临床方法过程中的困难原因,14岁
为了在再生人体免疫条件的高级小鼠模型中, 研究胰岛素抵抗和 NASH 发育过程中脂肪组织和肝脏中不同免疫细胞亚群的情况, 将小鼠置于半无菌的单独笼子中没有障碍的条件。在抗原暴露条件下的小鼠在喂养了13周高脂肪饮食 (hfd) 后, 已经发展了 nash 样的肝脏病理。与年龄匹配的 SPF 小鼠相比, 他们发展了巨囊性脂肪变性, 肝浸润和免疫细胞激活。
这份手稿描述了一个强大的流式细胞仪分析, 以定义和计数免疫细胞亚群从小鼠脂肪组织和肝脏在一个模型的 NASH。流式细胞术分析可以同时检测单个细胞的多个参数, 而不是 RT-PCR 或免疫组织化学方法。
总之, 我们的研究提供了一个小鼠模型的短期 HFD 调查胰岛素抵抗和 NASH 的发展, 以及潜在的机制, 也显示了对人类状况的忠诚度。
Protocol
Representative Results
Discussion
脂肪性肝炎与代谢异常 (如肥胖、胰岛素抵抗和血脂异常 15) 有很强的联系。多项研究表明, 脂肪组织炎症会推动2型糖尿病的发病机制, 包括先天免疫系统和适应性免疫系统细胞水平的改变 4,5,16,17.此外, 人们还发现, 肥胖调节免疫途径的激活, 可导致肝脏并发症 18.由?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢安克管辖、戴安娜·沃勒纳、凯瑟琳·威特博士和科内莉亚·赫克曼博士在实验程序方面的协助, 并感谢 Biolegend 的 Benjamin Tiburzy 对门控策略的有益评论。J. s. 得到了赫尔姆霍兹·格兰特 (ICMED) 的支持。这项研究得到了柏林卫生研究所临床研究股的赠款、德国联邦教育和研究部以及爱因斯坦基金会的 “bcrt 赠款” 的支持。K. S.-B。和 h. d. v. 由 FOR2165 提供资金。
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
Referencias
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
