Préparation et application d’un nouveau Biocapteur bactérien pour la détection présumée de résidus de balles
Summary
Un protocole est présenté à l’aide de techniques de biologie synthétique pour synthétiser un ensemble de biocapteurs bactériens pour l’analyse des résidus de balles, et pour tester le fonctionnement des dispositifs pour leur utilisation prévue à l’aide de la spectroscopie par fluorescence.
Abstract
MicRoboCop est un biocapteur qui a été conçu pour une application unique en chimie médico-légale. MicRoboCop est un système composé de trois dispositifs qui, lorsqu’ils sont utilisés ensemble, peuvent indiquer la présence de résidus de balles (GSR) en produisant un signal de fluorescence en présence de trois analytes clés (antimoine, plomb et composants organiques de GSR). Le protocole décrit la synthèse des biocapteurs à l’aide d’ Escherichia coli (E. coli) et les méthodes analytiques de chimie utilisées pour évaluer la sélectivité et la sensibilité des capteurs. Le fonctionnement du système est démontré par l’utilisation de GSR recueillies à l’intérieur d’un boîtier de cartouche usé. Une fois préparés, les biocapteurs peuvent être stockés jusqu’à ce que nécessaire et peuvent être utilisés comme un test pour ces analytes clés. Une réponse positive des trois analytes fournit un test présomptif positif pour le GSR, tandis que chaque dispositif individuel a des applications pour détecter les analytes dans d’autres échantillons (par exemple, un détecteur pour la contamination du plomb dans l’eau potable). La principale limitation du système est le temps nécessaire pour un signal positif; les travaux futurs peuvent impliquer l’étude de différents organismes pour optimiser le temps de réponse.
Introduction
Un biocapteur est un dispositif analytique qui utilise des composants biologiques (tels que des protéines, des acides nucléiques ou des organismes entiers) qui produisent une réponse qui peut être utilisée pour la détection d’une substance chimique ou d’un analyte. À titre d’exemple, l’industrie minière du charbon a utilisé un biocapteur pour une grande partie du XXe siècle pour détecter la présence de gaz toxiques pour les mines: le canari dans la mine de charbon1. La réponse de l’organisme biologique (canari) (mort ou détresse) à un analyte chimique (monoxyde de carbone) a été observée par les mineurs afin de protéger les travailleurs. Dans un exemple plus moderne et sophistiqué, les bactéries peuvent être modifiées à l’aide de techniques de biologie synthétique pour répondre à la présence d’un certain analyte chimique en exposant une réponse spécifique, telle que l’expression d’une protéine fluorescente.
La biologie synthétique est un terme général qui fait référence à la construction de dispositifs et de systèmes biologiques qui n’existent pas naturellement, ou à la reconception des systèmes biologiques existants à des fins spécifiques2. La biologie synthétique se distingue de l’ingénierie génétique par une méthodologie standard et l’existence de pièces normalisées (éléments génétiques de biologie synthétique standard) qui peuvent être utilisées pour synthétiser des dispositifs et des systèmes. Une partie est introduite dans le génome d’un dispositif, un organisme tel qu’une bactérie, pour exprimer un certain trait qui servira d’indication de fonction. Par exemple, dans de nombreux dispositifs synthétiques, l’expression d’une protéine fluorescente est introduite dans un organisme unicellulaire en tant que protéine reporter. Plusieurs appareils peuvent être combinés dans un système. Les génomes de microorganismes tels que les bactéries sont faciles à manipuler de cette manière. De nombreux exemples de biocapteurs spécifiques à un large éventail d’analytes chimiques ont été rapportés dans la littérature au cours de la dernière décennie3,4.
Dans ce travail, le système MicRoboCop est présenté comme un exemple d’un biocapteur conçu à l’aide de techniques de biologie synthétique avec des applications nouvelles dans la chimie médico-légale et environnementale. MicRoboCop est un système de trois dispositifs distincts qui, lorsqu’ils sont combinés, permettront à Escherichia coli d’exprimer des protéines fluorescentes rouges (RFP) en présence de résidus de balles (GSR) qui ont été recueillis à partir des mains d’une personne ou d’une surface. Chacun des trois dispositifs répond à un analyte chimique spécifique qui est connu pour être un composant de GSR5. Les trois analytes auxquels le système répond sont I. 2, 4, 6-trinitrotoluène (TNT) et les composés apparentés, II. plomb (sous forme d’ions de plomb) et III. antimoine (également sous forme d’ions).
Le GSR est composé de nombreuses substances chimiques différentes, mais les trois habituellement utilisées pour identifier un résidu comme GSR sont le baryum, le plomb et l’antimoine5. Le test de preuve standard pour l’identification du GSR consiste à utiliser la microscopie électronique à balayage (SEM) avec la fluorescence des rayons X à dispersion d’énergie (EDX)5. SEM-EDX permet aux analystes d’identifier la morphologie unique et les composantes élémentaires du GSR. Actuellement, il y a peu de tests de présomption binaires largement utilisés disponibles. Un test présomptif publié récemment utilise la spectroscopie de mobilité ionique (IMS), qui est un équipement spécialisé qui pourrait ne pas être disponible dans de nombreux laboratoires6. Il y a aussi quelques tests de couleur “Spot” qui peuvent être utilisés, bien qu’ils soient généralement utilisés pour la détermination de la distance ou pour l’identification GSR sur les trous de balle et les plaies5. En outre, il y a eu une certaine attention limitée dans la littérature aux essais électrochimiques pour le GSR qui emploient l’analyse voltammétrique, qui a l’avantage de potentiellement être portable de champ, ou la voltammétrie anodique de décapage, qui est un extrêmement méthode sensible pour les éléments métalliques7. Il est très peu mentionné dans la littérature des biocapteurs conçus spécifiquement dans le but de détecter le GSR, bien que certains biocapteurs pour d’autres applications médico-légales ont été publiés8.
Les éléments biologiques de chaque dispositif du système MicRoboCop et de la construction du plasmide sont illustrés à la figure 1. La flèche incurvée de la figure 1b représente la région promotrice qui est activée en présence de l’analyte, l’ovale est le site de liaison ribosomique qui permet la traduction de la protéine reporter, la boîte grise étiquetée RFP est le gène qui exprime le rouge la protéine fluorescente, et l’octole rouge est le site de terminaison de transcription. Tous les trois appareils seront utilisés ensemble comme un système pour détecter GSR. Chaque dispositif avec un promoteur spécifique (SbRFP, PbRFP, et TNT-RFP) sera incubé avec l’échantillon qui est testé et la fluorescence de la DDP sera mesurée. La DDP ne sera exprimée que si l’analyte chimique approprié est présent et active la région promotrice. Trois dispositifs qui répondent à certaines des substances chimiques présentes dans le GSR ont été conçus et sont présentés dans ce travail.
Les promoteurs utilisés dans les trois dispositifs microbocop sont un promoteur sensible à l’arsenic et à l’antimoine, sbrfp9,10, un promoteur sensible au plomb, pbrfp11,12 et un promoteur sensible à la TNT, TNT-RFP 13. parce qu’une recherche dans la littérature n’a révélé aucun promoteur conçu pour répondre au baryum, le promoteur de TNT a été choisi à la place puisque ce promoteur est sensible à un certain nombre de composés structurellement apparentés (en particulier, 2,4-Dinitrotoluène et dinitrobenzène) qui sont connus pour être une partie des composés organiques laissés derrière dans le GSR. Ce promoteur a été utilisé avec succès pour détecter spécifiquement les quantités de minute de TNT et de 2,4-Dinitrotoluène (2,4-DNT) dans les mines terrestres enterrées13. En utilisant les trois appareils ensemble comme un système, un test positif pour le GSR produira la fluorescence dans les trois dispositifs. Un signal de fluorescence dans seulement un ou deux dispositifs indiquera une autre source environnementale de l’analyte (s) ou dans le cas du promoteur de TNT, activation par un composé qui n’est pas un composé organique laissé derrière dans le GSR. En utilisant les trois appareils ensemble, la possibilité de résultats faussement positifs dus à des sources environnementales est minimisée. Les munitions sans plomb, qui gagnent en popularité, ne représentent toujours que 5% des ventes de munitions aux États-Unis; par conséquent, de faux résultats négatifs en raison de l’absence de plomb peut être une possibilité, mais il ya encore utilité dans un capteur qui utilise le plomb comme marqueur pour GSR14. En plus de cette application légale spécifique, chaque appareil peut être utilisé séparément à des fins de détection des contaminants environnementaux.
Les protocoles présentés incluent les techniques de biologie synthétique utilisées pour créer les dispositifs (bactéries de capteur) et les techniques analytiques pour vérifier la fonction des dispositifs et pour analyser les signaux de fluorescence obtenus. Le protocole comprend également la collecte de preuves médico-légales sous forme d’essuyage à la main pour recueillir le GSR des mains d’un suspect ou d’un souillonnage pour collecter le GSR à partir d’une surface. Les résultats du dispositif du capteur de plomb sont présentés comme des résultats d’exemple, ainsi qu’une démonstration d’un test positif pour le GSR à l’aide d’un boîtier de cartouche usé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifications et dépannage
L’expérience décrite dans le tableau 4 peut être modifiée de quelque manière que ce soit pour les capteurs qui ont été conçus. L’aspect le plus important d’un capteur chimique est d’évaluer sa sensibilité et sa spécificité. Il est bénéfique de s’assurer qu’une large gamme de concentrations de l’analyte est analysée pour déterminer la plage analytique utile du capteur. Il vaut également la peine de dét…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent reconnaître les étudiants de l’Université de Longwood dans BIOL 324 (Genetics) et les étudiants de CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory résolution de problèmes) qui ont été impliqués dans la préparation initiale et l’essai des biosenseurs d’antimoine et de plomb. L’idée de MicRoboCop a été conçue à l’atelier GCAT SynBIO (été 2014), qui est financé par NSF et Howard Hughes Medical Institute et hébergé par l’Université du Maryland comté de Baltimore. Les auteurs reconnaissent également le financement reçu du Collège des arts et des sciences Cook-Cole de l’Université de Longwood et de la bourse des anciens de GCAT SynBio.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
Referencias
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