Визуализация белка киназы активность в голову фиксированной вести мышей, используя в Vivo двухфотонная флуоресценция Пожизненная микроскопия изображений
Summary
Процедура представлена для визуализации белка киназы деятельности в голову фиксированной, ведя мышей. Улучшенный a-kinase репортер активности, tAKAR, выражается в корковых нейронов и сделал доступным для визуализации через окно черепа. Двухфотонная флуоресценция визуализации микроскопии используется для визуализации деятельности PKA in vivo во время принудительного передвижения.
Abstract
Нейромодуляция оказывает мощный контроль над функцией мозга. Дисфункция нейромодуляционных систем приводит к неврологическим и психическим расстройствам. Несмотря на их важность, технологии для отслеживания нейромодуляторных событий с клеточным разрешением только начинают появляться. Нейромодуляторы, такие как допамин, норадреналин, ацетилхолин и серотонин, вызывают внутриклеточные сигнальные события через соответствующие G белковые рецепторы для модулирования нейрональной возбудимости, синаптической коммуникации и других нейронных функции, тем самым регулируя обработку информации в нейронной сети. Вышеупомянутые нейромодуляторы сходятся на пути cAMP/protein kinase A (PKA). Таким образом, in vivo PKA изображений с одноклеточным разрешением была разработана в качестве считыватель для нейромодуляторных событий в порядке, аналогичном визуализации кальция для нейрональной электрической деятельности. В этом виде представлен метод визуализации активности ПКА на уровне отдельных нейронов в коре головного мозга, подаренного мышам. Для этого используется улучшенный репортер активности А-киназы (AKAR), называемый такаре, который основан на рецензировании энергии Фюрстера (FRET). Этот генетически закодированный датчик PKA вводится в моторную кору через внутриутробное электропорацию (IUE) плазмид ДНК, или стереотаксическая инъекция адено-ассоциированного вируса (AAV). Изменения FRET отображаются с помощью двухфотонных флуоресценции визуализации изображения микроскопии (2pFLIM), которая предлагает преимущества по сравнению с коэффициентом метрических измерений FRET для количественной оценки сигнала ФРЕТ в светорассеянии ткани мозга. Для изучения деятельности PKA во время принудительного передвижения, tAKAR’ изображен через хроническое окно черепа над корой бодрствования, голова фиксированной мышей, которые работают или отдыхают на скорости контролируемых моторизованной беговой дорожке. Этот подход к визуализации будет применим ко многим другим областям мозга для изучения соответствующих действий PKA, вызванных поведением, и к другим датчикам на основе FLIM для визуализации in vivo.
Introduction
Нейромодуляция, также известная как медленная синаптическая передача, налагает сильный контроль над функцией мозга во время различных поведенческих состояний, таких как стресс, возбуждение, внимание и движение1,2,3, 4. Несмотря на свою важность, изучение того, когда и где происходят нейромодуляционные события, все еще находится в зачаточном состоянии. Нейромодуляторы, в том числе ацетилхолин, допамин, норадреналин, серотонин, и многие нейропептиды, активировать G белковых рецепторов (GPCRs), которые, в свою очередь, вызывают внутриклеточные второго посыльного пути с широким окном временных шкалы, начиная от секунд до нескольких часов. В то время как каждый нейромодулятор вызывает определенный набор сигнальных событий, путь cAMP/protein kinase A (PKA) является общим нисходящего пути для многих нейромодуляторов1,5. Путь CAMP/PKA регулирует возбудимость нейронов, синаптической передачии пластичность 6,7,8,9,и, следовательно, настраивает динамику нейронной сети. Поскольку различные нейроны или типы нейронов выражают различные типы или уровни нейромодуляторных рецепторов10, внутриклеточные эффекты одного и того же внеклеточного нейромодулятора могут быть неоднородными в разных нейронах, и, таким образом, должны быть изучалс с сотовым разрешением. На сегодняшний день, она остается сложной задачей для мониторинга нейромодуляционных событий в отдельных нейронов in vivo во время поведения.
Для изучения пространственно-временной динамики нейромодуляции требуется подходящий способ записи. Микродиализ и быстро сканная циклическая вольтаметрия часто используются для изучения выпуска нейромодуляторов, но им не хватает пространственного разрешения для мониторинга клеточных событий11,12. Аналогии с динамикой кальция используется в качестве прокси для нейронной электрической активности в визуализации населения13, PKA изображения могут быть использованы для чтения нейромодуляторных событий по всей нейронной популяции в клеточном разрешении. Настоящий протокол описывает использование улучшенного репортера активности A-kinase (AKAR) для мониторинга деятельности PKA in vivo во время поведения животных. Описанный здесь метод позволяет одновременно визуализировать нейронные популяции в субклеточном разрешении с временным разрешением, которое отслеживает физиологические нейромодуляционные события.
AKA, состоят из донора и приемного флуоресцентных белков, связанных пептидом фосфорилирования PKA и вилоголовым, связанным (FHA) доменом, который связывается с фосфорилированным серином или трионином субстрата14,15. При активации pKA пути, пептид субстрата АКАР фосфорилирован. В результате домен FHA связывается с фосфорилированным пептидом субстрата, тем самым в результате чего два флюорофора в непосредственной близости, именуемый закрытым состоянием АКАР. Закрытое состояние фосфорилированного АКАР приводит к увеличению рецензированной рецензной передачи энергии Фюрстера (FRET) между донором и принимающим флюорофорами. Так как доля фосфорилированных АКАР связано с уровнем активности PKA16,количество FRET в биологической выборке может быть использовано для количественной оценки уровня деятельности PKA16,17,18, 19,20.
Ранние версии АКАР были в первую очередь разработаны для двухцветной социометрической визуализации14. При визуализации глубже в ткани мозга, коэффициентеметрический метод страдает от искажения сигнала из-за волны зависит рассеяния света17,18,21. Как уже говорилось ниже, флуоресценция жизни изображений микроскопии (FLIM) устраняет эту проблему, потому что FLIM измеряет только фотоны, испускаемые донором фторофора18,21. В результате, FLIM количественной freT не зависит от ткани глубины17. Кроме того, может быть использован вариант фторофора с «темным» (т.е. низкой квантовой доходностью). Это освобождает цветной канал для облегчения мультиплексного измерения ортогональных нейронных свойств с помощью одновременных изображений второго датчика или морфологического маркера17,19,20.
FLIM визуализации количественно время, что фторофор проводит в возбужденном состоянии, т.е. флуоресценции жизни18. Возвращение фторофора в наземное состояние, таким образом, конец возбужденного состояния, часто сопутствует эмиссии фотона. Хотя эмиссия фотона для отдельной возбужденной молекулы является стохастической, в популяции средняя продолжительность жизни флуоресценции является характерной чертой этого конкретного фторофора. Когда чистая популяция фторофоров возбуждается одновременно, полученная флуоресценция последует за одним экспоненциальным распадом. Время константы этого экспоненциального распада соответствует среднему сроку службы флуоресценции, которая обычно колеблется от одной до четырех наносекунд для флуоресцентных белков. Возвращение возбужденного донорского фторора в наземное состояние может также произойти с помощью ФРЕТ. При наличии ФРЕТ срок службы флуоресценции донорского флюорофора уменьшается. Нефосфорилированные АКАР обладают относительно более длительной продолжительностью жизни донорской флуоресценции. При фосфорилировании PKA, датчик проявляет более короткий срок службы, потому что донор и принимающий флюорофоры привозятся рядом друг с другом и FRET увеличивается. Таким образом, количественная оценка продолжительности жизни флуоресценции в популяции АКАР представляет уровень активности PKA.
Ранние версии АКАР не были успешно использованы для in vivo изображений с одноклеточным разрешением. Это в основном связано с низкой амплитудой сигнала датчиков АКАР к физиологическим активациям17. Недавно, систематически сравнивая доступные датчики AKAR для двухфотонных флуоресценции визуализации микроскопии (2pFLIM), датчик под названием FLIM-AKAR было установлено, превзойти альтернативные датчики. Кроме того, была разработана серия вариантов FLIM-AKAR, называемых целевыми АКАР (такарами) для визуализации активности ПКА в конкретных субклеточных местах: микротрубочки (такаре), цитозола (ТАКАР), актина (такаре), нитевидного актина (такаре), мембраны (такаре), и постсинаптическая плотность (такаря). Среди ТАКАР, ТАКАРЕ увеличила амплитуда сигнала, вызванную норадреналином, в 2,7 раза. Это согласуется с осознанием того, что большинство PKA в нейронах закреплены на микротрубах в состоянии покоя22,23. ТАКАРЕ был лучшим исполнителем среди существующих AKAДляи для 2pFLIM. Кроме того, таКАРАЗ обнаружил физиологически релевантную активность ПкА, вызванную несколькими нейромодуляторами, а выражение такараз не изменило нейронные функции17.
В последнее время, ТАКАРЗ был успешно использован для визуализации PKA деятельности в голову фиксированной себя мышей17. Было показано, что принудительное движение вызвало активность PKA в соразмере нейронов поверхностного слоя (слой 1 через 3, до глубины 300 мкм от пиа) в двигателе, стволе и зрительных кортиках. Активность PKA, вызванная передвижением, частично зависела от сигнализации через адренергические рецепторы и рецепторы D1 допамина, но не была подвержена влиянию антагониста дофаминовых рецепторов D2. Эта работа иллюстрирует способность tAKARs отслеживать события нейромодуляции в vivo с помощью 2pFLIM.
В текущем протоколе весь метод визуализации активности PKA у мышей с фиксированной головой во время принудительной парадигмы передвижения описан в шести шагах. Во-первых, добавление возможностей 2pFLIM к обычному двухфотонный микроскоп(рисунок 1). Во-вторых, строительство моторизованной беговой дорожки(рисунок 2). В-третьих, выражение датчика такарара в коре мыши при внутриутробном электропорации (IUE) плазмид ДНК, или стереотаксической инъекции адено-ассоциированного вируса (AAV). Ранее были опубликованы отличные протоколы для операций для IUE24,25 и стереотаксической инъекции вирусных частиц26. Ключевые параметры, которые мы использовали, описаны ниже. В-четвертых, установка черепного окна. Отличные протоколы были ранее опубликованы для черепно-мозговой хирургии27,28. Описано несколько шагов, которые были изменены из стандартных протоколов. В-пятых, выступая в vivo 2pFLIM. В-шестых, анализ 2pFLIM изображения(Рисунок 3 и Рисунок 4). Этот подход должен быть легко применим ко многим другим головокружичным поведенческим парадигмам и областям мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол демонстрирует использование датчика FRET-FLIM tAKAR для визуализации нейромодуляции триггера PKA деятельности в голову фиксированной себя мышей. Это приложение основано на обширном тестировании и характеристиках tAKAR’ in vitro и in vivo, чтобы продемонстрировать, что полученный сигнал …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жу Тесс J. Lameyer, г-жа Рут Франк, и д-р Майкл А. Muniak для редактирует и комментарии, и д-р Ryohei Ясуда на Макс Планк Флорида для 2pFLIM приобретения программного обеспечения. Эта работа была поддержана двумя наградами BRAIN Initiative U01NS094247 (H.) и T.M.) и R01NS104944 (H.A. и T.M.), грантом R01NS081071 (T.M.) и грантом R21 R21. Все награды от Национального института неврологических расстройств и инсульта, Соединенные Штаты.
Materials
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
Referencias
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).
- Berke, J. D. What does dopamine mean?. Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).
- Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).
- Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).
- Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).
- Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).
- Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).
- Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).
- Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).
- Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
- Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).
- Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).
- Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).
- Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).
- Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).
