Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.
Abstract
Cholangiopathies, die extrahepatische Gallengänge (EHBDs) beeinflussen, gehören biliären Atresie, Primär sklerosierende Cholangitis und Gallengangskarzinom. Sie haben keine effektive therapeutische Optionen. Werkzeuge, um EHBD zu studieren, sind sehr begrenzt. Unser Ziel war es, eine Organ-spezifischen, vielseitig, Erwachsenen Stammzellen abgeleitet, präklinische Cholangiocyte Modell zu entwickeln, die leicht vom Wildtyp und gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden können. So berichten wir über die neuartige Technik der Entwicklung eines EHBD organoide (EHBDO) Kultur von Erwachsenen Maus EHBDs. Das Modell ist kostengünstig, leicht analysiert werden, und hat mehrere downstream-Anwendungen. Im einzelnen beschreiben wir die Methodik der Maus EHBD Isolation und einzelne Zelle Dissoziation, organoide Kultur Einleitung, Fortpflanzung, und langfristige Wartung und Lagerung. Dieses Manuskript beschreibt auch EHBDO Verarbeitung für Immunohistochemistry, Fluoreszenz-Mikroskopie und mRNA Fülle Quantifizierung durch Echtzeit-quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Dieses Protokoll hat deutliche Vorteile neben der Produktion von EHBD-spezifische Organellen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums aus L-WRN Zellen reduziert deutlich die Kosten für dieses Modell. Die Verwendung der Maus EHBDs bietet fast unbegrenzte Gewebe für Kultur-Generation, im Gegensatz zu menschlichem Gewebe. Generierte Maus EHBDOs enthalten eine reine Bevölkerung von Epithelzellen mit Markern der endodermische Stammvater und differenzierte biliären Zellen. Kultivierte Organellen homogene Morphologie durch mehrere Gänge zu erhalten und nach längerer für langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff gewonnen werden können. Das Modell ermöglicht die Untersuchung der Gallenwege Stammvater Zellproliferation, pharmakologisch manipuliert werden und kann aus gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden. Zukünftige Studien werden benötigt zur Optimierung der Kulturbedingungen um Effizienzsteigerung Beschichtung, funktionale Zelle Reife und direkten Zell-Differenzierung zu bewerten. Entwicklung von Kokulturen Modellen und einer mehr biologisch neutral extrazelluläre Matrix sind ebenfalls wünschenswert.
Introduction
Cholangiopathies sind unheilbare chronische progressive Störungen, die biliären Zellen in Intra- und extrahepatische Gallenwege Kanäle (EHBDs)1betreffen. Einige Cholangiopathies, wie primäre sklerosierende Cholangitis, Gallengangskarzinom und biliären Atresie Choledochal Zysten betreffen überwiegend EHBDs. Entwicklung von Therapien für Cholangiopathies ist durch die begrenzte Verfügbarkeit von präklinischen Modellen eingeschränkt. Darüber hinaus früheren Studien konzentrierten sich auf Cholangiopathies zusammengefasst: Leber, Intra- und EHBDs. Allerdings Intra- und EHBDs haben einen ausgeprägten embryonalen Ursprung, und gilt somit als unterschiedliche molekulare Pathologien. Intrahepatischen Gallenwege entwickeln sich aus den intrahepatischen duktalen Platten und der kranialen Teil der hepatischen Divertikel, ganze EHBDs zu entwickeln, aus dem kaudalen Teil des hepatischen Divertikel2. Sie verlassen sich auch auf verschiedene Vorläuferzellen Zelle Fächer für Erwachsene Homöostase, einschließlich Kanäle von Hering in intrahepatischen Gallenwege und Peribiliary Drüsen im EHBDs2,3. Verwendung von Tiermodellen für präklinische Studien wird durch Kosten begrenzt und aus ethischen Gründen minimiert werden. Reduktionistische, reproduzierbare, Zeit und Kosten sparende in-vitro-Modelle sind daher sehr wünschenswert.
Die meisten frühere Studien von Cholangiopathies verwendete normale Maus oder Ratte Krebs Modelle oder menschlichen Gallengangskarzinom Zelllinien aus intra- und EHBDs4,5,6,7. Aber diese sind Modelle der transformierten Zellen und nicht normal Cholangiocyte Biologie Homöostase oder in einem gesunden Zustand rekapitulieren. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von organotypischen Kultur Modellen ermöglichte die Entwicklung von 3-dimensionalen Strukturen aus verschiedenen Gewebetypen, einschließlich Artischockenblättern Gewebe, obwohl nicht normale Maus EHBDs8,9, 10. Diese “Orgel-ähnlichen” Strukturen abzielen, primäre Gewebe imitiert und in eine künstliche Nische Unterstützung Selbsterneuerung der Organ-spezifischen Stamm/Stammvater Zellen11angebaut.
“Organoide” ist ein breiter Begriff, der meisten allgemein beschreibt 3-dimensionale Gewebemodelle Stammzellen abgeleitet. Organellen können aus umprogrammiert pluripotenten generiert werden Stammzellen vertreten durch embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen. Sie können auch aus adulten Stammzellen organspezifischen12generiert werden. Einige Cholangiocyte organoide Modelle wurden in früheren Studien vorgeschlagen. So, Organellen, die von menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet wurden berichteten7,9,13 und sind wertvoll, Zeit effiziente Tools, die für die gleichzeitige Erzeugung von verschiedenen Zelltypen ermöglicht. Diese pluripotenten Stammzelle-derived Organellen spiegeln jedoch nicht vollständig die Struktur und Funktionalität der primären adult EHBD Cholangiocytes.
Organellen von adulten Stammzellen des menschlichen9 abgeleitet und feline10 Leber wurden auch vorgeschlagen. Feline Modelle sind nicht weit verbreitet und haben begrenzte Tool Rüstzeug zu Studienzwecken. Darüber hinaus können diese Leber abgeleitet adulten Stem Cell-derived Organellen nicht extrahepatische Cholangiocytes aber eher intrahepatischen Cholangiocytes modellieren.
EHBD organoide Generation wurde von menschlichen normal EHBDs14 und Maus EHBD Gallengangskarzinom15berichtet. Allerdings Zugang zu menschlichen EHBD Gewebe ist äußerst begrenzt, und Organellen, abgeleitet von einer genetischen Mausmodell Gallengangskarzinom15 repräsentieren nicht gesund Cholangiocyte Biologie an der Homöostase und genetisch veränderten Zellen abgeleitet sind.
Um die Grenzen der pluripotenten Stammzelle – und Leber-derived Cholangiocyte organoide Modelle und des eingeschränkten Zugangs zu menschlichem Gewebe benötigt in präklinischen Modellen zu begegnen, haben wir ein EHBD organoide Mausmodell (Abbildung 1A) entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung einer Technik für Maus EHBD-abgeleitete Organellen von Erwachsenen Gewebe. Diese EHBD Organellen benannt EHBDOs werden in-vitro-Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die EHBDs Cholangiocyte Homöostase und Krankheit Prozesse, z. B. Cholangiopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt die Generation eine organotypischen 3-dimensionales Modell der Maus EHBD Cholangiocytes. Wichtige Schritte zur EHBDO Kultur Generation gehören sorgfältige EHBD Dissektion zur Vermeidung von Bauchspeicheldrüse Zelle Kontamination, Wartung von sterilen Bedingungen gegen Bakterien- und Pilzinfektionen Kontamination und sorgfältige Manipulation nach der Zentrifugierung zu vermeiden die Verlust von Zellmaterial. Eine enge Einhaltung der beschriebenen Temperaturbedingungen ist erforderlich. Es gibt …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der American Association für die Studie der Leber Krankheiten Pinnacle Award (n.r.) und die National Institutes of Health, National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen (awards P30 DK34933, n.r., P01 DK062041, J.L.M.) unterstützt. Wir danken Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) für seine Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
Referencias
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