Bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes
Summary
We demonstreren eencellige cultuur van bacteriën in gigantische blaasjes (GVS). Gv’s met bacteriële cellen werden bereid door de druppel overdrachtsmethode en werden geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat voor directe observatie van bacteriële groei. Deze aanpak kan ook worden aangepast aan andere cellen.
Abstract
We ontwikkelden een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen gigantische blaasjes (GVS). Bacteriële celcultuur is belangrijk voor het begrijpen van de functie van bacteriële cellen in de natuurlijke omgeving. Vanwege de technologische vooruitgang kunnen verschillende bacteriële celfuncties op het eencellige niveau in een besloten ruimte worden onthuld. Gv’s zijn sferische micro-sized compartimenten samengesteld uit amfifiele lipide moleculen en kan verschillende materialen, met inbegrip van cellen houden. In deze studie werd een enkele bacteriële cel ingekapseld in 10 – 30 μm GVs door de druppel overdrachtmethode en werden de Gv’s die bacteriële cellen bevatten geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat. Onze methode is nuttig voor het observeren van de real-time groei van enkele bacteriën binnen GVs. We gekweekte Escherichia coli (E. coli) cellen als een model binnen GVS, maar deze methode kan worden aangepast aan andere celtypen. Onze methode kan worden gebruikt in de wetenschap en industriële gebieden van microbiologie, biologie, biotechnologie, en synthetische biologie.
Introduction
De cultuur van bacteriële cellen op het eencellige niveau heeft steeds meer aandacht gekregen. Het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau in een besloten ruimte kan een verheldende werking van bacteriële functies zoals fenotypische variabiliteit1,2,3,4, Celgedrag5, 6 , 7 , 8 , 9, en antibioticaresistentie10,11. Door de recente ontwikkelingen in cultuur technieken kan de cultuur van enkele bacteriën worden bereikt in een besloten ruimte, zoals in een goed-chip4,7,8, gel druppel12,13 en water-in-olie (W/O) druppel5,11. Om het begrip of gebruik van enkele bacteriële cellen te bevorderen, zijn verdere technische ontwikkelingen van teelttechnieken nodig.
Blaasjes die de biologische celmembraan nabootsen zijn sferische compartimenten bestaande uit amfifiele moleculen en kunnen verschillende materialen vasthouden. Blaasjes zijn geclassificeerd op grootte en omvatten kleine blaasjes (SVs, diameter < 100 nm), grote blaasjes (LVs, 1 μm). SVs of Lv’s worden vaak gebruikt als medicijn dragers vanwege hun affiniteit met het biologische celmembraan14. Gv’s zijn ook gebruikt als een reactor systeem voor de bouw van protocellen15 of kunstmatige cellen16. Inkaping van biologische cellen in GVS is gemeld17,18, en dus GVS tonen potentieel als een celkweek systeem in combinatie met het reactor systeem.
Hier beschrijven we samen met een video van experimentele procedures hoe Gv’s kunnen worden gebruikt als nieuwe celkweek schepen19. Gv’s met bacteriën werden gemaakt door de druppel overdrachtsmethode20 en werden vervolgens geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een afdekglas. We gebruikten dit systeem om bacteriële groei op het eencellige niveau binnen GVs in real-time te observeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen GVs. Deze eenvoudige methode omvat het vormen van gv’s met bacteriële cellen op het eencellige niveau door gebruik te maken van de druppel overdrachtsmethode. Vergeleken met andere benaderingen voor het verkrijgen van Gv’s die bacteriële cellen bevatten, heeft deze methode twee voordelen: (i) het is gemakkelijk te ontwikkelen en (II) een klein volume (2 μL) van de monsteroplossing is nodig om de GVs te bereiden. De d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een toonaangevend initiatief voor uitstekende jonge onderzoekers (LEADER, No. 16812285) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan, een subsidie-in-Aid voor onderzoek jonge wetenschappers (nr. 18K18157, 16K21034) van Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) tot M.M., en subsidie-in-Aid van MEXT naar K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
Referencias
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
