Silenciamiento de genes mediado por Lentiviral en pseudoislet humano preparado en placas de baja fijación

Summary

Se presenta un protocolo para crear pseudoislotes humanos modificados genéticamente a partir de células de islotes humanos dispersas que son transducidas por lentivirus que transportan ARN de horquilla corta (ARN de shRNA). Este protocolo utiliza enzimas y vasos de cultivo fácilmente disponibles, se puede realizar fácilmente y produce pseudoislotes humanos modificados genéticamente adecuados para estudios funcionales y morfológicos.

Abstract

Hay varias herramientas genéticas disponibles para modular genes en islotes pancreáticos de roedores para diseccionar la función de los genes de los islotes para la investigación de la diabetes. Sin embargo, los datos obtenidos de los islotes de roedores a menudo no se reproducen completamente en o son aplicables a los islotes humanos debido a diferencias bien conocidas en la estructura y función de las islotes entre las especies. Actualmente, las técnicas que están disponibles para manipular la expresión génica de los islotes humanos son muy limitadas. Introducción de transgén en islotes intactos por adenovirus, plásmido, y oligonucleótidos a menudo sufre de baja eficiencia y alta toxicidad. La baja eficiencia es especialmente problemática en los estudios de regulación genética en islotes intactos, que requieren una alta eficiencia. Se ha sabido que las células de los islotes dispersos enzimáticamente se reagregan en cultivo formando esferoides llamados pseudoislotes. La reagregación controlada por tamaño de las células de los islotes humanos crea pseudoislotes que mantienen la secreción dinámica de insulina en primera fase después de un cultivo prolongado y proporcionan una ventana para introducir eficientemente ARN de horquilla corta lentiviral (ARN) con baja toxicidad. Aquí, se describe un protocolo detallado para la creación de pseudoislotes humanos después de la transducción lentiviral utilizando dos placas multipocillos disponibles comercialmente. El protocolo se puede realizar fácilmente y permite una regulación eficiente de los genes y la evaluación del dinamismo de la secreción de insulina utilizando células de isla humana. Por lo tanto, los pseudoislotes humanos con modulación génica mediada lentiviral proporcionan un modelo potente y versátil para evaluar la función génica dentro de las células de los islotes humanos.

Introduction

La pérdida de masa beta celular funcional es la patologíacentral de la diabetes tipo 1 y tipo 2 1. Si bien las células beta son los productores de insulina en los islotes pancreáticos, lacomunicación entre las células beta y las células no beta desempeña un papel crítico en la regulación de la secreción de insulina 2. Además, la desregulación de la secreción de glucagón contribuye a la hiperglucemia en la diabetes³. Por lo tanto, existe un gran interés en modular la expresión génica de las células dentro de los islotes pancreáticos para abordar el mecanismo detrás del desarrollo de la disfunción de los islotes en la diabetes. Una variedad de enfoques, incluyendo ratones transgénicos están disponibles para modular la expresión génica de islotes de ratón. Sin embargo, los islotes humanos y de ratón muestran una inervación distinta, distribución celular, relación de células beta a alfa y respuesta a secretagogos^4. Por lo tanto, la evaluación directa de la función génica en los islotes humanos es extremadamente importante para entender la fisiopatología de los islotes pancreáticos humanos.

El vector adenoviral es el vector viral más utilizado para transducir islotes pancreáticos in vitro debido a la alta eficiencia de la transducción en células no divisorias. Sin embargo, el adenovirus no penetra en el núcleode los islotes de manera eficiente, especialmente en los islotes humanos 5, y es citotóxico a dosis altas^6. Comparativamente, el vector lentiviral es menos citotóxico y suministra genes exógenos permanentemente en el cromosoma de lascélulas postmitoticas, lo que lo convierte en un vehículo ampliamente probado para la terapia génica 7. Sin embargo, la capacidad del lentivirus para penetrar en el núcleo de los islotes humanos intactos también es limitada, por lo que requiere la dispersión parcial por digestión enzimática para aumentar la eficiencia de transducción⁸. La salvedad con la dispersión de islotes humanos intactos es la interrupción de la comunicación célula-célula y célula-matriz, que compromete la regulación dinámica de la secreción de insulina crítica para el mantenimiento de la homeostasis de glucosa en humanos⁹. Por lo tanto, ha sido difícil evaluar el impacto de la modulación génica en la regulación dinámica de la función de los islotes en un modelo de islotes humanos.

Se ha sabido que las células de los islotes dispersos de los islotes humanos y roedores se reagregan de forma autónoma en estructuras similares a islotes llamadas “pseudoislotes”. Los pseudoislotes muestran una distribución de células beta y no beta similar a los islotes nativos^10,11. Además, después de un cultivo a largo plazo,los islotes nativos pierden progresivamente la secreción de insulina robusta de primera fase 5,^10,11,12. Sin embargo, los pseudoislotes demostraron una mejor preservación de la secreción de insulina de primera fase en respuesta a la glucosa en comparación con los islotes nativos después del mismo período de cultivo^5. Además de tener una mejor preservación de la secreción de insulina, la reagregación controlada por tamaño de las células de los islote humanos en placas de baja fijación¹¹ proporciona una ventana de oportunidad para introducir vectores de lentivirus antes de su reagregación en pseudoislatas. Varios estudios han demostrado la utilidad de los pseudoislotes combinados con la transducción mediada lentiviral. 13 informaron que la introducción de la proteína fluorescente verde (GFP) que expresaba el lentivirus tenía poco efecto sobre la secreción de insulina mientras se logralaba la expresión homogénea de GFP en pseudoislotes de rata en comparación con el control no infectado. También demostraron el efecto específico de las diferentes conexiones en la secreción de insulina al sobreexpresar las connexinas 32, 36 y 43 a través de lentivirus¹³. Los pseudoislotes humanos preparados con una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos disponible comercialmente demostraron que la sobreexpresión mediada por lentiviral del factor de transcripción SIX3 mejora la secreción de insulina evaluada por incubación estática¹⁴. Recientemente, los pseudoislotes humanos preparados con una placa de unión ultrabaja de 96 pocillos se utilizaron para regular la glucoquinasa a través de ARN de horquilla corta lentiviral (shRNA) como prueba de principio para demostrar que la secreción de insulina estimulada por la glucosa se reduce, mientras que La secreción de insulina estimulada por KCl se conservó⁵. El estudio también demostró que los pseudoislotes humanos son similares a los islotes nativos en la expresión génica y los perfiles secretores, apoyando aún más la utilidad de los pseudoislotes humanos para diseccionar la regulación de la función de islotes⁵. Aunque no se realizó la perifusión, también se informó que una placa de cultivo de micropocillos bioingeniería que recientemente estuvo disponible comercialmente, también era compatible para la transducción lentiviral y producía pseudoislotes humanos que mostraban una excelente insulina secreción in vitro e in vivo después del trasplante^11. Colectivamente, la formación de pseudoislotes humanos combinados con la transducción lentiviral es un enfoque simple y eficiente para investigar la fisiopatología de los islotes humanos, proporcionando una valiosa herramienta para realizar estudios mecánicos en islotes humanos.

En el informe actual, se presenta un protocolo para formar pseudoislotes humanos transducidos con lentivirus utilizando dos plataformas disponibles comercialmente, una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos y una placa de cultivo de micropocillos. Ambos logran una modulación eficiente de la expresión génica y crean pseudoislotes humanos que son compatibles con las evaluaciones posteriores, incluida la incubación estática y la perifusión.

Protocol

Antes del inicio de los estudios, la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa hizo una determinación de investigación de sujetos humanos, que determinó que el estudio no cumplía con los criterios para la investigación de sujetos humanos. Consulte a la junta de revisión local antes del inicio del estudio para determinar si la fuente de los islotes y el estudio planificado requiere aprobación previa. NOTA: Típicamente, 1,200-1,400 islotes equivalentes (…

Representative Results

La Figura 1 ilustra los pasos clave en la producción de pseudoislotes utilizando una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos y una placa de cultivo de micropocillos. La Figura 2a muestra cambios secuenciales en la morfología durante la formación de pseudoislotes de 3 x 103 células de islotes humanos en una placa de unión ultra baja de 96 pocillos. Los grupos monocapa o sueltos de células observadas en el día…

Discussion

Aquí, se presenta un protocolo detallado para generar pseudoislotes humanos que son transducidos por lentivirus usando una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos o una placa de cultivo de micropocillos. Se ha informado que los pseudoislotes demuestran morfología y funciones secretoras similaresa los islotes humanos nativos y pueden ser cultivados durante un tiempo prolongado in vitro 5,^11,18. A diferencia de los islotes h…

Materials

Anti-adherence rinsing solution	Stemcell technologies	7919
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 Series Type A2
cell strainer, 40 micrometer	Corning	431750
CMRL-1066	ThermoFisher	11530037
CO2 incubator	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i
conical centrifuge tube, 15 mL	VWR	89039-666
conical centrifuge tube, 50 mL	VWR	89039-658
fetal bovine serum	ThermoFisher	26140079
guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent	ThermoFisher	15596026	Trizol
glutamine	ThermoFisher	25030164
Hemocytometer	Marien Feld	Neubauer-Improved Bright line
Human serum albumin	Sigma	A1653
inverted microscope	Fisher brand	11-350-119
microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 20
microcentrifuge tube, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
microwell culture plate	Stemcell technologies	34411	Aggrewell 400, 24 well
motor-driven pestle	GAMUT	#399X644
non-tissue culture treated dish, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713
PBS	ThermoFisher	14190250
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	10378016
Petri dish, 35 mm	Celltreat	229638
pipette, 5 mL	DOT Scientific,	667205B
pipette, 8-channel	VWR	#613-5253
pipette, 10 mL	VWR	667210B
pipette, P10	Denville	UEZ-P-10
pipette, P200	Denville	UEZ-P-200
pipette, P1000	Denville	UEZ-P-1000
proteolytic and collagenolytic enzyme mixture	Sigma	A6965	Accutase
reagent reservoir, 50 mL	VWR	89094-680
reversible strainer, 37 micrometer	Stemcell technologies	27251
swing bucket plate centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-14R
swing bucket rotor	Beckman Coulter	SX4750A
tuberculin syringe, 1 mL	BD	309659
ultra low attachment microplate, 96 well	Corning	4515