Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Summary

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden. hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Abstract

Die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und Zellen ist ideal für die Untersuchung biologischer und physiologischer Prozesse wie der Regenerationsprozess des Skelettmuskels. Es gibt anerkannte Herausforderungen bei der Arbeit mit menschlichen primären adulten Stammzellen, insbesondere menschlichen Muskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsien abgeleitet sind, einschließlich geringer Zellausbeute aus gesammeltem Gewebe und einem hohen Grad an Spenderheterogenität Wachstums- und Todesparameter zwischen den Kulturen. Während die Integration von Heterogenität in experimentelles Design eine größere Stichprobengröße erfordert, um signifikante Effekte zu erkennen, ermöglicht es uns auch, Mechanismen zu identifizieren, die der Variabilität der hMPC-Erweiterungskapazität zugrunde liegen, und ermöglicht es uns, die Sbeinen-Erweiterungskapazität besser zu verstehen. Heterogenität in der Skelettmuskelregeneration. Neuartige Mechanismen, die die Expansionsfähigkeit von Kulturen unterscheiden, haben das Potenzial, zur Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Regeneration der Skelettmuskulatur zu führen.

Introduction

Skelettmuskel ist das größte Organsystem im menschlichen Körper, macht 30 bis 40% der ganzen Körpermasse¹. Neben seiner anerkannten Rolle in der Fortbewegung, Skelettmuskel hält Körpertemperatur und Körperhaltung, und spielt eine zentrale Rolle in ganzkörperlichen Nährstoff Homöostase. Die Forschung unter Beteiligung menschlicher Teilnehmer, Tiere und Zellkulturmodelle ist wertvoll, um Fragen der Skelettmuskelbiologie und Regeneration zu beantworten. Isolation und Kultur der menschlichen Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs) bietet ein robustes Modell, das es ermöglicht, Zellkulturtechniken und Manipulationen auf menschliche Proben anzuwenden. Ein Vorteil der Verwendung von hMPCs ist, dass sie den genetischen und metabolischen Phänotyp von jedem Spender behalten^2,3. Die Aufrechterhaltung des Spenderphänotyps ermöglicht es forschern, interindividuelle Variationen im myogenen Prozess zu untersuchen. Zum Beispiel haben wir unsere hMPC-Charakterisierungsmethode eingesetzt, um alters- und geschlechtsbedingte Unterschiede in der hMPC-Populationsexpansionskapazität⁴zu identifizieren.

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Techniken zur Isolierung, Kultur, Charakterisierung und Unterscheidung von hMPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe zu beschreiben. Aufbauend auf früheren Arbeiten, die hMPCs beschrieben und potenzielle Zelloberflächenhersteller für die hMPC-Isolierung^5,6identifiziert haben, schließt dieses Protokoll eine kritische Wissenslücke, indem es die Isolation mit der Charakterisierung von hMPCs verknüpft. Darüber hinaus machen die detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitungen in diesem Protokoll die hMPC-Isolierung und -Charakterisierung einem breiten wissenschaftlichen Publikum zugänglich, einschließlich derjenigen mit begrenzter Vorerfahrung mit hMPCs. Unser Protokoll gehört zu den ersten, die die Verwendung eines bildgebenden Zytometers zur Verfolgung von Zellpopulationen beschreiben. Neu entwickelte bildgebende Zytometer sind modernste, hochdurchsatz- und mikroplattenbasierte, die live zellbildende, Zellzählung und Mehrkanalfluoreszenzanalyse aller Zellen in jedem Brunnen eines Kulturgefäßes innerhalb von Minuten ermöglichen. Dieses System ermöglicht eine schnelle Quantifizierung dynamischer Veränderungen der Proliferation und Lebensfähigkeit einer gesamten Zellpopulation mit nur minimalen Unterbrechungen der Kultur. Beispielsweise sind wir in der Lage, objektive Maßnahmen des Zusammenflusses an aufeinanderfolgenden Tagen in vitro durchzuführen, um die Wachstumskinetik jeder Kultur zu bestimmen, die von verschiedenen Spendern abgeleitet wurde. Viele Protokolle in der Literatur, insbesondere solche, die die Differenzierung von MFC beinhalten, erfordern, dass Zellen ein definiertes Maß an Zusammenfluss erreichen, bevor sie Differenzierung oder Behandlung einführen⁷. Unsere Methode ermöglicht eine objektive Bestimmung des Zusammenflusses jedes Brunnens in einem Kulturgefäß, so dass Forscher eine unvoreingenommene, nicht-subjektive Behandlung initiieren können.

In der Vergangenheit war eine wesentliche Einschränkung der Verwendung von primären hMPCs niedrige Erträge, die die Anzahl der Zellen begrenzen, die für Experimente verfügbar sind. Wir und andere haben gezeigt, dass die Ausbeute von MPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe 1-15 MPCs pro Milligramm Gewebe beträgt (Abbildung 1)⁸. Da unser Protokoll vier Passagen der Zellen vor der Reinigung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zulässt, reichen unsere kryokonservierten hMPC-Erträge, die aus kleinen Mengen Biopsiegewebe (50 bis 100 mg) gewonnen werden, aus, um Forschungsziele zu erreichen, mehrere Experimente sind erforderlich. Unser FACS-Protokoll erzeugt eine reine (Pax7-positive) MPC-Population von 80 %, daher ist unser Protokoll sowohl für die Ausbeute als auch für die Reinheit optimiert.

Protocol

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Review Board der Cornell University genehmigt. Alle Teilnehmer wurden auf die zugrunde liegenden gesundheitlichen Bedingungen untersucht und gaben ihre Einwilligung in Kenntnis der Sachlage ab. 1. Beschaffung von menschlichem Muskelgewebe über die Skelettmuskelbiopsie Identifizieren Sie den Vastus lateralis Muskel durch Palpation, anatomische Landmarken und aktive Kontraktion des Muskels. Palpate die vastus lateralis, indem der Teil…

Representative Results

Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der hMPC-Isolierung aus menschlichem Muskelgewebe können in Abbildung 1dargestellt werden. hMPCs können durch erste Gating-Ereignisse identifiziert werden, die auf Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung basieren, um abgestorbene Zellen oder Trümmer zu beseitigen, gefolgt von der Auswahl nur von Zellen, die für 7-AAD negativ sind und daher lebensfähig sind. Die Auswahl der Zellen, die sowohl für die Zelloberf…

Discussion

Primäre hMPCs sind ein wichtiges Forschungsmodell, das verwendet wird, um skelettierte Muskelbiologie und den regenerativen Prozess zu verstehen. Darüber hinaus haben hMPCs das Potenzial, für die Therapie verwendet zu werden. Es gibt jedoch anerkannte Herausforderungen bei der Verwendung von primären hMPCs für Forschung und Therapie, einschließlich des begrenzten Verständnisses von Zellen, die vom Menschen abgeleitet sind¹⁰. Es gibt auch eine große Variation in der Expansionskapazität zwi…

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100X Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings