Génération d'organoïdes tumoraux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés du cancer de la prostate
Summary
Nous montrons une méthode pour l’autopsie et la dissection des modèles de cancer de la prostate de souris, se concentrant sur la dissection de tumeur de prostate. Un protocole étape par étape pour la génération des organoïdes de tumeur de prostate de souris est également présenté.
Abstract
Les méthodes basées sur la recombinaison homologue pour modifier des gènes ont considérablement favorisé la recherche biologique. Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) sont une méthode rigoureuse pour étudier le développement et la maladie des mammifères. Notre laboratoire a développé plusieurs GEMMs du cancer de la prostate (PCa) qui manquent d’expression d’un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur utilisant le système de recombinase de Cre-loxP site-spécifique et un promoteur prostate-spécifique. Dans cet article, nous décrivons notre méthode pour l’autopsie de ces GEMMs de PCa, se concentrant principalement sur la dissection des tumeurs de prostate de souris. De nouvelles méthodes développées au cours de la dernière décennie ont facilité la culture des cellules épithéliales pour modéliser les systèmes d’organes in vitro en trois dimensions. Nous détaillons également une méthode de culture cellulaire 3D pour produire des organoïdes de tumeur des GEMMs de PCa de souris. La recherche préclinique sur le cancer a été dominée par la culture cellulaire 2D et les modèles de xénogreffe dérivés de lignées cellulaires ou dérivés du patient. Ces méthodes manquent de microenvironnement tumoral, une limitation de l’utilisation de ces techniques dans les études précliniques. GemMs sont plus physiologiquement-pertinents pour comprendre la tumorigénèse et la progression du cancer. La culture organoïde de tumeur est un système in vitro de modèle qui récapitule l’architecture de tumeur et les caractéristiques de lignée cellulaire. En outre, les méthodes de culture cellulaire 3D permettent la croissance des cellules normales pour la comparaison aux cultures de cellules de tumeur, rarement possible utilisant des techniques de culture cellulaire 2D. En combinaison, l’utilisation des GEMM et de la culture cellulaire 3D dans les études précliniques a le potentiel d’améliorer notre compréhension de la biologie du cancer.
Introduction
Depuis la fin des années 1980, la capacité de modifier les gènes par recombinaison homologue a grandement avancé l’étude des systèmes biologiques1. Les systèmes promoteurs inductibles, tissulaires ou cellulaires et les recombinases spécifiques au site, comme Cre-loxP, ont fait progresser les études génétiques en facilitant le contrôle des modifications génétiques tant temporellement que spatialement2,3, 4. La combinaison de ces stratégies génétiques a créé un large éventail de systèmes de modèles expérimentaux5,6,7.
Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) sont un outil intégral pour évaluer comment les gènes individuels ou les groupes de gènes affectent le développement et la maladie des mammifères. Dans la recherche préclinique sur le cancer, les GEMM sont la méthode la plus pertinente sur le plan physiologique et la plus rigoureuse pour étudier le développement, la progression et le traitement du cancer8. Notre laboratoire est spécialisé dans la génération et la caractérisation des GEMM cancéreux.
Le cancer non cutané le plus fortement diagnostiqué chez les hommes aux États-Unis est le cancer de la prostate (PCa). La majorité des patients atteints de PCa ont une maladie à faible risque et une forte probabilité de survie, mais les taux de survie diminuent considérablement lorsque la maladie est diagnostiquée à des stades avancés ou si l’hormonothérapie ciblée induit une progression vers une PCa agressive et non curable. sous-types9,10. Notre laboratoire a développé des GEMM qui utilisent des alleles floxed d’un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur. La recombinaison et la perte de l’expression de gène de suppresseur de tumeur se produit spécifiquement dans la prostate parce que nous avons introduit un transgène avec Cre recombinase en aval du promoteur de probasin activé seulement dans les cellules épithéliales de prostate11, 12. Nous avons également élevé nos GEMMpour contenir un transgène Cre reporter appelé mT/mG, qui induit l’expression de protéines fluorescentes de tomate dans les cellules dépourvues d’expression de cre et de protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules avec Cre13. Tandis que la présentation de cette méthode et nos résultats représentatifs montrent GEMMs que nous étudions dans notre laboratoire, ce protocole peut être employé pour produire des organoïdes de cancer de la prostate à partir de n’importe quel modèle de souris. Cependant, comme discuté en détail dans notre section représentative de résultats, nous avons observé que certaines caractéristiques de tumeur sont optimales pour la génération d’organoïdes de cancer de la prostate.
Au cours de la dernière décennie, de nouvelles méthodes de culture des cellules à partir de tissus d’origine épithéliale ont conduit à des progrès significatifs dans notre capacité à modéliser les systèmes d’organes in vitro14,15. Le terme « culture cellulaire 3D » a été attribué aux techniques impliquées dans l’établissement et le maintien des organoïdes, qui peuvent généralement être définis comme des structures composées de cellules qui assemblent l’architecture secondaire entraînée par la lignée cellulaire spécifique à l’organe caractéristiques16. Ces nouvelles méthodes sont distinctes de la culture classique des cellules 2D en ce que les cellules ne nécessitent pas de transformation ou d’immortalisation pour la croissance à long terme; ainsi, les cultures 3D des cellules normales peuvent être comparées aux cellules malades. Ceci est particulièrement utile dans la recherche sur le cancer où les cultures normales de contrôle cellulaire n’ont généralement pas été disponibles. En outre, les organoïdes forment spontanément des architectures de tissus secondaires avec des types de cellules correctement différenciés, ce qui en fait un meilleur système modèle pour comprendre le cancer in vitro que les lignées cellulaires 2D17. Notre laboratoire a créé des lignes organoïdes 3D à partir de la question tumorale isolée de nos GEMM PCa pour compléter nos données in vivo et effectuer des expériences qui ne seraient pas réalisables dans les GEMM.
Dans cet article, nous présentons des protocoles écrits et visuels pour l’autopsie complète des GEMM de PCa, y compris la dissection des lobes distincts de prostate de souris et des lésions métastatiques. Nous décrivons et montrons une méthode étape par étape pour produire des organoïdes des tumeurs de prostate de souris basées sur un protocole précédemment édité par Drost et autres pour dériver des organoïdes du tissu épithélial normal de prostate de souris18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques dans le protocole pour la dissection de tumeur de prostate et la génération d’organoïde
Le déplacement du tissu non-prostate et de la dissection fine de la tumeur de prostate de souris est crucial pour la génération optimale des organoïdes de cancer puisque les cellules épithéliales non-prostate et les cellules épithéliales normales de prostate produiront des organoïdes. Pour les tumeurs solides de prostate spécifiquement, il est crucial d’isoler des secteurs de tumeur v…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiens à remercier le laboratoire Calvin Kuo de l’Université Stanford d’avoir fourni des cellules HEK293 transfectées de la souris Noggin-Fc ou de la souris Ha Rspo1-Fc. Nous tenons également à remercier le Dr Dean Tang de nous avoir permis d’avoir accès au microscope à dissection fluorescente dans son laboratoire. Ce travail a été soutenu par CA179907 à D.W.G. de l’Institut national du cancer. Les ressources partagées du Roswell Park Comprehensive Cancer Center ont été appuyées par la subvention de soutien CA016056 des National Institutes of Health Cancer Center.
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
Referencias
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