대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

Summary

여기서, 우리는 사 멸 티 모 세포와 복 막 대 식 세포를 준비 하 고 efferocytosis 및 특정 억제제의 효율성을 분석 하 사 멸 티 모 세포의 침 지에 관한 프로토콜을 제시 한다. 이 프로토콜은 인공 구슬과 박테리아를 포함 한 다른 입자의 세포 매개 클리어런스에 광범위 한 응용 프로그램을가지고 있습니다.

Abstract

세포 자 멸은 자연 스러운 과정으로 서 배아 발달, 항상성 조절, 면역 내성 유도 및 염증의 해결에 중요 한 역할을 한다. 바디에 있는 사 멸 파편의 축적은 시간이 지남에 따라 전신 자기 면역 질병으로 이끌어 내는 만성 선 동적인 반응을 시작할 수 있습니다. 손상 된 사 멸 세포 클리어런스는 다양 한 자가 면역 질환에 연루 되었습니다. 사 멸 클리어런스는 생리학적 조건에서 거의 검출 되지 않는 복잡 한 과정입니다. 그것은 풍부한 표면 수용 체 및 신호 분자를 포함 한다. 사 멸 세포 클리어런스 과정을 연구 하는 것은 통찰력 있는 분자 메커니즘과 후속 생물학적 반응을 제공 하 여 새로운 치료제의 발달로 이어질 수 있습니다. 여기에서 우리는 사 멸 티 모 세포의 유도를 위한 프로토콜, 복 막 대 식 세포의 준비, 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에의 한 사 멸 세포 클리어런스 분석을 설명 합니다. 모든 세포는 특정 단계에서 아 폽 토시 스를 겪을 것 이며, 많은 주거 및 순환 세포는 사 멸 파편을 흡수 할 수 있다. 따라서 여기에 설명 된 프로토콜은 많은 다른 세포 유형에 의해 사 멸 세포 결합 및 섭취를 특성화 하기 위해 여러 응용 프로그램에서 사용 될 수 있습니다.

Introduction

우리 몸은 매일 1-10 억 사 멸 세포를 생성 합니다. 이러한 많은 수의 사 멸 세포는 면역 반응이 정지 상태를 유지 하는 방식으로 지워야 합니다. 적시에 사 멸 세포의 틈새를 지키기 위하여는, 조직 주민 세포의 수많은 모형 및 회람 세포는 사 멸 세포를 삼 켜 하는 기계 장치를 개발 합니다¹. 아 폽 토시 스의 기능 장애 조절은 다양 한 염증 성 질환 및 자기 면역의 발병 및 진행에 연루 되어 있다². 아 폽 토시 스는 또한 종래의 치료법^3,4에 대 한 그의 후속 내성 및 암 발병의 발병 기 전에 서 중요 한 역할을 한다. 사 멸 세포의 제거는 일반적으로 면역 내성⁵에 연결 될 수 있는 항 염증 반응을 촉진 합니다. 사 멸 세포 클리어런스의 교란은 자기 면역을 촉진 하 고 인간 및 생쥐⁶의 전신 자가 면역 질환의 발병에 기여 합니다.

세포가 아 폽 토시 스를 겪을 때, 그들은 포스 파티 딜 세 린 (PtdSer)을 내부 리플 렛에서 멤브레인의 외부 리플 렛에 노출 시킵니다. PtdSer는 표면 수용 체를 통해 식 세포에 의해 인식 될 것입니다. 12 개 이상의 수용 체는 사 멸 세포의 침 몰을 인식 및/또는 촉진 하는 것으로 확인 되었습니다. 일반적으로, 사 멸 세포 클리어런스에 관여 하는 표면 수용 체의 적어도 3 가지의 종류가 있습니다: 테 더 링 수용 체, 사 멸 세포를 인식; 수용 체 간 질, 침 몰 시작; 수용 체, 전체 과정을 용이 하 게⁷. 탐 수용 체 티로신 키나 제 (TAM RTKs)는 Tyro-3, xl 및 Mer로 구성 되 고 주로 면역 시스템 (⁸)의 골수성 세포에 의해 표현 된다. TAM RTKs의 주된 기능은 테 더 링 수용 체 역할을 하 여 사 멸 세포와 파편의 포식 제거를 촉진 하는 것입니다. 우리 그룹은 수 년 동안 자동 면역의 설정에서 TAM 매개 사 멸 세포 클리어런스를 연구 했습니다. 비타민 K-의존성 단백질 성장 체포 특이 단백질 6 (Gas6) 및 단백질 S (프로)는 탐 수용 체를 결합 및활성화 시킨다. Gas6는 심장, 신장 및 폐에서 생산 됩니다. 프로는 주로 간에 서 생산¹¹. TAM은 Gas6/프로의 N-말단이 사 멸 세포에 PtdSer에 결합 하 고 Gas6/프로의 C-말단을 식 세포의 표면에 부착 된 탐 수용 체에 결합 하는 방식으로 사 멸 셀을 인식 한다. 다른 수용 체와 함께, 사 멸 세포의 침 몰은 발생¹². Mer는 리간드 프로와 Gas6 모두에 결합할 수 있지만, 우리는 항-메 르 항 체 (¹³)에 의해 차단 될 수 있는 사 멸 세포에 대 한 mer 매개 식 세포의 포식에 대 한 유일한 리간드 인 것으로 Gas6 것으로 나타났습니다. 대 식 세포는 전문 포식 세포입니다. 식 세포에의 한 사 멸 세포의 급속 한 클리어런스는 세포내 항 원에 대 한 염증 및 자가 면역 반응의 억제에 중요 합니다. Mer 수용 체 티로신 키나 아 제는 대 식 세포 침 적 및 효율적인 사 멸 셀 (¹⁴)의 클리어런스에 중요 하다. 마우스 비장에서 Mer는 주로 한계 구역과 유형 신체 대 식 세포¹³에 대해 표현 합니다.

여기에 제시 된 프로토콜은 세포 사 멸을 유도 하 고 efferocytosis의 과정과 효율성을 측정 하는 방법을 입증 하는 기본적인 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 기원의 사 멸 세포의 침 몰에서 다른 세포 유형에 의해 efferocytosis를 연구 하기 위하여 쉽게 적응 될 수 있습니다.

Protocol

실험 마우스는 우리의 마우스 콜로 니에서 사육 되 고 유지 되었다. 모든 동물 작업은 신시내티 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행 되었다. 1. CFSE 표지 된 사 멸 계 세포의 준비 두 명의 순진한 C57/B6 마우스를 CO2 흡입 하 여 흉 강을 열고 해 부에 2 개의 생쥐를 안락사 시키고, 10 ML의 RPMI1640 배지를 함유 하는 조직 배양 페 트리 디쉬?…

Representative Results

복 막 대 식 세포의 분석-사 멸 티 세포의 매개 침 몰. 복 막 대 식 세포 및 사 멸는 상기 프로토콜에 기재 된 바와 같이 제조 하 고 공동 배양 하였다. 대 식 세포는 분리 되 고 얼음에 20 분 동안 PE 공액 항 CD11b 항 체로 염색 되었다. 대 식 세포는 이어서 유 세포 계에서 세척 및 처리 되었다. 본 바와 같이, 사 멸 세포가 배양 물에 첨가 되지 않았을 때 우측 하단 사분면에는 CFSE 양성 대 식…

Discussion

세포 사 멸은 많은 신호 캐스케이드를 수반 하 고 단백질 발현, 분 비 및 수송을 유도 하는 고도로 보존 된 세포 사 멸 과정 이다. 아 폽 토시 스는 종종 세포 형태학 변화 (¹⁷)와 연관 된다. 사 멸 세포는 사이트에 이주 하 고 엄격한 통제¹⁸에서 매우 복잡 한 통로의 과정을 시작 하는 포식을 유치 하는 사이토카인 및 케 모카 인를 활발히 풀어 놓습니다. 한편, 괴 사…

Materials

Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.