종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용
Summary
시험관내 세포 침습 분석기는 단백질 매트릭스를 함유하는 세포 배양 삽입을 사용하여 침입 및 이동을 위한 세포 전이를 정량화함으로써 암 전이의 잠재력을 측정하는데 사용된다. 세포는 단백질 매트릭스와 다공성 막을 통해, 화학유도제를 향해, 그 때 가벼운 현미경 검사법에 의해 정량화되기 위하여 도전됩니다.
Abstract
시험관 내 침범 분석술은 보이든 챔버에서 단백질이 풍부한 매트릭스를 사용하여 암세포 전이의 초기 단계와 유사한 과정에서 배양된 세포가 매트릭스 및 다공성 막을 통과하는 능력을 측정한다. 시험된 세포는 유전자 발현을 위해 변경되거나 억제제로 처리되어 침략 잠재력의 변화를 테스트할 수 있다. 이 실험은 마우스 유방 종양 세포의 공격적인 표현형을 시험하여 세포 침입을 촉진하는 잠재적인 종양 유전자를 발견하고 특성화합니다. 그러나 이 기술은 다재다능하고 다양한 응용 분야에 적용될 수 있습니다. 실험 자체는 하루에 할 수 있고 결과는 하루 안에 가벼운 현미경 검사법에 의해 얻어집니다. 결과는 비교 및 분석을 위한 침입 세포의 수의 수를 포함합니다. 시험관 내 침범 분석법은 생체 외 분석법에 더 관여하기 전에 초기 평가로서 사용될 수 있는 배양에서 세포 거동을 결정하기 위한 신속하고 저렴하며 명확한 방법이다.
Introduction
시험관 내 침범 분석은 전이의 첫 번째 단계와 유사하게 단백질 코팅 막을 통해 이동하는 세포의 능력을 측정할 때 유용한 도구가 될 수 있습니다. 악성 암세포의 주요 특징은 인근 조직을 통해 이동하고 침입하는 능력입니다. 퍼지거나 전이한 암은 더 많은 처리 도전을 제기하고 현지화한 종양이 취급하기 쉽고 장기 생존의 더 높은 비율이 있는 동안 장기 생존의 더 낮은 비율이 있습니다. 전이하기 위하여는, 암세포는 1 차적인 종양을 떠나 순환계 또는 림프계로 이동해야 합니다, 세포외 매트릭스 및지하 막을 통과하는 것을 요구하는 프로세스 1. 상피 중간엽 전이 (EMT)라고하는 과정에서 종양 세포는 세포 접촉을 끊고, 방향을 마이그레이션하고, 근처의 혈액 이나 림프관을 침범해야합니다. 이 전이 폭포의 초기 단계는 이 단계가 암을 치명적으로 만들 수 있는 무슨이기 때문에 큰 관심사입니다. 전이의 초기 단계에 관여하는 유전적 및 후생유전학적 요인은 많은 양의 연구의 초점이지만, 정확하고 신뢰할 수 있는 실험 도구는 생체 내 및 시험관 내에서 이러한 초기 단계를 테스트하는 데 필요합니다.
연한 한천 분석실험과 같은 3D 환경에서 상처 치유(스크래치) 분석또는 성장과 같은 세포 이동의 변화를 측정하는 도구는 전이의 초기 단계를 측정하는 실험적 방법의 필요성을 부분적으로 해결할 수 있지만, 침략을 측정하는 분석법은 프로세스가 복잡한 종양 미세 환경 내의 바디에서 생기기 때문에 더 도전적입니다. 침범 및 전이에서 중요한 인자를 결정하기 위해 약물 또는 유전자 변경을 스크리닝하기 위한 목적으로, 배양된 세포와 함께 시험관내에서 사용할 수 있고생체 내에서 전이성 세포가 직면한 과제를 모방할 수 있는 시스템은 침략 분석2, 3. 유방암은 여자에 있는 암의 가장 일반적으로 진단된 모형이고 여자에 있는 암 죽음의 두 번째 주요한 원인, 그래서 유방암 세포 침략 및 전이에 책임 있는 유전자를 이해하는 것은 공중 위생을 위해 매우 중요합니다. 더욱이, 마우스 세포는 유방암과 그것의 진행을 공부하기위한 유용한 모델 시스템입니다.
시험관 내 침략 분석제는 성장 매체의 2개의 약실이 다공성 막3에의해 분리되는 Boyden 챔버 어셈블리를 기반으로 합니다. 종양 미세 환경을 모방하기 위해, 단백질이 풍부한 겔은 또한 다른 한 챔버에서 화학력으로부터 세포를 분리하고 지하 막 장벽으로 작용하기 위해 포함된다. 화학 유착제로 이동하기 위하여는, 세포는 먼저 단백질이 풍부한 방벽을 통과하고 다공성 막을 통과해야 합니다 – 전이성 세포가 기질을 통해 이동하는 방법과 유사한 프로세스. 단백질이 풍부한 겔은 실험의 필요에 따라 변경될 수 있지만, 일반적으로 콜라겐, 또는 지하 막 추출물(예를들어, 마트리겔)4로 구성된다. 단백질, 프로테오글리칸 및 성장 인자의 복잡한 혼합물이지만 대부분 라미닌과 콜라겐 IV 4,5로구성됩니다. 세포는 일반적으로 폴리 카보네이트, 폴리 에스테르 또는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)로 만들어진 다공성 멤브레인을 통과해야합니다. 멤브레인은 단백질 겔(전형적으로 콜라겐)의 유무에 관계없이 상업적으로 구입될 수 있거나, 또는 겔을 별도로 구입하여 첨가할 수 있다. 기공 크기는 세포 크기에 따라 조정할 수 있습니다. 공극 크기는 0.4 – 8.0 μm에서 사용할 수 있지만 3.0 – 8.0 μm의 기공만 세포 이동에 충분히 큽합니다. 침략 분석은 세포가 이동하고 침입하는 능력에 대한 억제제의 효과를 결정하는 데 사용되었습니다. 생체 내에서 존재하는 정확한 종양 미세 환경이 부족하면서, 시험관내 침습 분석실험은 동물 모델의 필요성을 최소화하면서 짧은 시간에 많은 조건을 스크리닝하는 데 유리하다. 이러한 실험의 목적은 의심되는 종양유전자의 유전자 발현을 비교하고 시험관내 침범 분석 및 기타 검사를 사용하여 암세포 행동 및 질병 공격성에 미치는 영향을 결정하는 것이다. 전반적으로, 침략 분석법은 상대적으로 저렴하고 간단하며 적응 가능한 방법인 동시에 전이성 전위를 결정하기 위한 일관되고 정량적이며 신속한 결과를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시험관 내 침범 분석법은 암세포 침입을 촉진하는 요인을 연구하기 위한 저렴하고, 신속하고, 정량적이며, 간단한 방법이다. 유방암은 여자 중 가장 일반적으로 진단된 암입니다. 유방암의 3개의 중요한 특수형의, 삼중 음성, (또는 ER-, PR-, HER2/neu -), 가장 공격적이고, 전이할 가능성이 가장 높으며, 가장 치명적인9. 따라서 전이를 초래하는 유전자와 발현을 이해하면 질병에…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국가 학회에서 교부금 R15CA169978에 의해 지원되었다. 추가 기금은 빌라노바 대학에서 왔다.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
Referencias
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Investigación sobre el cáncer. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Investigación sobre el cáncer. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
