Double imagerie de bioluminescence de la progression tumorale et de l'angiogenèse
Summary
Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle de souris tumeur-portant pour surveiller la progression de tumeur et l’angiogenèse en temps réel par la formation image double de bioluminescence.
Abstract
L’angiogenèse, comme un processus crucial de progression tumorale, est devenue un point chaud de recherche et la cible de la thérapie anti-tumorale. Cependant, il n’y a aucun modèle fiable pour tracer la progression et l’angiogenèse de tumeur simultanément d’une manière visuelle et sensible. L’imagerie par bioluminescence montre sa supériorité unique dans l’imagerie vivante en raison de ses avantages de sensibilité élevée, de forte spécificité et de mesure précise. Présenté ici est un protocole pour établir un modèle de souris tumeur-portant en injectant une renilla luciferase-étiquetée ligne de cellules de cancer du sein de monourine 4T1 dans la souris transgénique avec l’expression de luciferase de Firefly angiogenèse-induite. Ce modèle de souris fournit un outil valable pour surveiller simultanément la progression de tumeur et l’angiogenèse en temps réel par la double imagerie de bioluminescence dans une souris simple. Ce modèle peut être largement appliqué dans le criblage de drogue antitumoral et la recherche d’oncologie.
Introduction
L’angiogenèse est un processus essentiel dans la progression du cancer de petits néoplasmes localisés à de plus grandes tumeurs potentiellement métastatiques1,2. La corrélation entre la croissance tumorale et l’angiogenèse devient l’un des points d’emphase dans le domaine de la recherche en oncologie. Cependant, les méthodes traditionnelles de mesure des changements morphologiques ne parviennent pas à surveiller la progression de tumeur et l’angiogenèse simultanément chez les animaux vivants en utilisant une approche visualisée.
L’imagerie de bioluminescence (BLI) des cellules de tumeur est une méthode expérimentale particulièrement appropriée pour surveiller la croissance de tumeur en raison de sa non-invasiveness, sensibilité, et spécificité3,4,5,6 . La technologie BLI est basée sur le principe que la luciferase peut catalyser l’oxydation d’un substrat spécifique tout en émettant la bioluminescence. La luciférase exprimée dans les cellules tumorales implantées réagit avec le substrat injecté, qui peut être détecté par un système d’imagerie vivant, et les signaux reflètent indirectement les changements dans le nombre de cellules ou la localisation cellulaire in vivo6,7.
À l’exception de la croissance tumorale, l’angiogenèse tumorale (l’étape critique de la progression du cancer) peut également être visualisée par la technologie BLI à l’aide de souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI8,9,10. Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (Vegf) récepteur 2 (Vegfr2), un type de récepteur Vegf, est principalement exprimé dans les cellules endothéliales vasculaires des souris adultes11. Chez les souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI, la séquence d’ADN de la luciferase Firefly (Fluc) est frappée dans le premier exon de la séquence endogène Vegfr2. En conséquence, le Fluc est exprimé (qui apparaît sous forme de signaux BLI) d’une manière identique au niveau d’angiogenèse chez la souris. Pour se développer au-delà de quelques millimètres de taille, la tumeur recrute de nouvelles vascularisations à partir de vaisseaux sanguins existants, qui expriment fortement le Vegfr2 déclenché par des facteurs de croissance des cellules tumorales1. Ceci ouvre la possibilité d’utiliser des souris transgéniques vegfr2-Fluc-KI pour surveiller non-invasivement l’angiogenèse de tumeur par BLI.
Dans ce protocole, un modèle de souris tumeur-portant est établi pour surveiller la progression de tumeur et l’angiogenèse dans une souris simple par le luciferase de Luciferase de Feu (Fluc) et la luciferase de Renilla (Rluc) image, respectivement (figure 1). Une lignée cellulaire 4T1 (4T1-RR) est créée qui exprime de façon stable le Rluc et la protéine fluorescente rouge (RP) pour retracer la croissance cellulaire par imagerie Rluc. Pour étudier plus avant les changements dynamiques de l’angiogenèse dans la progression et la régression de la tumeur, une autre lignée cellulaire 4T1 (4T1-RRT) est créée qui exprime le virus de l’herpès simplex de gène de suicide tronqué thymidine kinase (HSV-ttk), Rluc, et RFP. Par administration de ganciclovir (GCV), les cellules exprimant hSV-ttk sont sélectivement ablated. Basé sur ces lignées cellulaires, un modèle tumoral-portant dans les souris de Vegfr2-Fluc-KI est construit qui sert de modèle expérimental reliant la progression de tumeur et l’angiogenèse de tumeur in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, une approche double BLI non-invasive est décrite pour surveiller le développement de tumeur et l’angiogenèse. Le système de journaliste BLI est d’abord développé, contenant le gène de suicide DeSV-ttk/GCV pour suivre la progression et la régression de tumeur in vivo par l’imagerie de Rluc. Pendant ce temps, l’angiogenèse tumorale est évaluée à l’aide de souris Vegfr2-Fluc-KI via l’imagerie Fluc. Ce modèle de souris tumeur-portant est capable de fournir une plate-forme pratique pour le dév…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée par le National Key R-D Program of China (2017YFA0103200), la National Natural Science Foundation of China (81671734) et les principaux projets du Programme de soutien scientifique et technologique de Tianjin (18YFZCSY00010), les fonds de recherche fondamentale pour les Universités centrales (63191155). Nous reconnaissons les révisions de Gloria Nance, qui ont été utiles pour améliorer la qualité de notre manuscrit.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
Referencias
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