Anjiogenik potansiyelinin In vivo çalışması için Işlenmiş tümör ilişkili Nötroflelerin tümör taşıyan fareler içine aktarılması
Summary
Burada, tümör taşıyan farelere transferinden sonra anti-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofiller terapötik potansiyelini gösteriyoruz. Bu protokol, nötrofil aktivitesini ex vivo olarak işlemek ve daha sonra tümörlerin geliştirilmesinde in vivo olarak işlevselliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Potansiyel nötrofil bazlı immünoterapileri incelemek için uygun bir modeldir.
Abstract
Nötrofiller, tümörijenezde düzenlenmesi katkısı artan dikkat çekiyor. Bu hücreler heterojen ve tümör ortama bağlı olarak yanlısı veya anti-tümör kapasitesine sahip olabilir. Tümör bağlamında nötrofil fonksiyonlarını düzenleyen önemli sitokinlerden biri ben interferonlar türüdür. İnterferonlar varlığında, nötrofil anti-tümör özellikleri kazanmak, sitotoksisite veya bağışıklık sisteminin stimülasyon dahil. Bunun tersi olarak, bir interferon sinyalinin eksikliği, tümör anjiyogenezinin güçlü stimülasyon ile karakterize belirgin Pro-tümör aktivitesinde sonuçlanır. Son zamanlarda, nötrofiller yanlısı anjiyojenik özelliklerinin bu hücrelerdeki nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) sinyalizasyon yolunun aktivasyonuna bağlı olduğunu gösterebiliriz. Tümör ilişkili nötrofiller bu yolun inhibisyonu onların güçlü anti-anjiyojenik fenotipi yol açar. Burada, yeni kurulan modelimizi, manipüle tümör ilişkili nötrofiller (Tans) ‘ nın tümörojenik potansiyelinin in vivo olarak değerlendirilmesine olanak tanıyarak gösteriyoruz. Kısa bir süre, Pro-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofiller tümör taşıyan interferon-eksikliği fareler izole edilebilir ve NAMPT sinyalizasyon bloke ederek Anti-anjiyojenik fenotipi içine repolarize. Bu hücrelerin anjiyojenik aktivite daha sonra bir aort halka tahlil kullanılarak değerlendirilebilir. Anti-anjiyojenik TANs tümör taşıyan vahşi tip alıcılara aktarılabilir ve tümör büyümesi 14 gün boyunca izlenmelidir. Günde 14 fare feda edilir, tümör kaldırıldı ve vazkülarizasyon ile kesilmiş değerlendirildi. Genel olarak, protokollerimiz, yapay nötrofil hücre hattı modellerini kullanmaya gerek kalmadan, tümör ilişkili nötrofiller gibi primer hücrelerin anjiyojenik kapasitesini değerlendirmek için yeni bir araç sağlar. Vc
Introduction
Tip ı Interferonlar (ıfns) neoplasias ana tepkiler stimülasyon önemli bir rol oynar, tip ı ıFN eksikliği önemli ölçüde yüksek tümör büyümesi sonuçları sinyal1. Bu süreçte yer alan mekanizmalardan biri, koloniye uyarıcı faktör 3 reseptör (CSF3R) aşağı sinyal2ile kontrol edilen tümör ilişkili nötrofiller, tümör-genetik aktivitesinin düzenlenmesi. Koloniye uyarıcı faktör 3 (CSF3) veya granülosit kolonisi uyarıcı faktör, nikotinamid phosphoribosyltransferase (nampt)3,4içeren sinyalizasyon etkinleşmeye gösterilmiştir. NAMPT, glikoliz geliştirir ve DNA onarımı, gen ifadesi ve stres tepkisi kanser hücrelerinin hayatta kalma ve proliferasyon teşvik düzenleyen nikotinamide adenin dinükleotit sentezini için bir oran sınırlayıcı enzimdir5. NAMPT, kolorektal, ovaryalı, meme, mide, prostat kanseri ve gliomas6dahil olmak üzere birden fazla kanser tipinde aşırı ifade edilir. NAMPT sadece tümör hücreleri için değil, aynı zamanda miyeloid hücreler gibi tümörlerde bulunan diğer hücre türlerinin geniş bir çeşitliliği için de önemlidir-onların farklılaşma4Sürücüler, apoptozis inhibe ve çoklu sitokinlerin ifade teşvik veya makrofajlar içinde matris-aşağılayıcı enzimler7.
Tümör ilişkili nötrofiller tümör büyümesinin önemli modülatörlerini temsil eder. BRONZLAŞMA fonksiyonları nötrofiller bu sitokinler Prime anti-tümör aktivitesi olarak, türü ı ıFN kullanılabilirlik güçlü bağlıdır. Aksine, ıfns yokluğunda bu hücrelerin tümör aktivasyonunu destekler, özellikle kendi yanlısı anjiyojenik özellikleri. Bununla anlaşmada, INS eksikliği fareler önemli ölçüde daha büyük ve daha iyi vaskülarize tümörlerin geliştirmek, hangi güçlü yanlısı tümörü ile sızan/Pro-anjiyojenik nötrofiller1,2,8, 9,10. Daha da önemlisi, bu tür Pro-anjiyojenik TANs NAMPT yüksek aktivite göstermek, nötrofiller Pro-tümör polarizasyon temel rolünü düşündürmektedir.
Nötrofiller Ly6G antikor veya göç inhibisyonu kullanarak tükenmesi (CXCR2 antikor) azalmış tümör anjiyogenez sonuçları, büyüme, ve metasjen1,8. Yine de, oluşturulan monoklonal antikorlar immunogenic, ve onların yönetimi yaşam tehdit yan etkileri bir dizi ile ilişkilidir11. Nötrofil tumoriogenicity modüle nampt inhibitörü FK866 gibi küçük moleküller ile tedavi, bu tür komplikasyonları önlemek için yardımcı olabilir. Ne yazık ki, NAMPT farmakolojik sistemik inhibisyonu, tümör büyümesi üzerinde terapötik etkisi yanında, gastrointestinal toksisite ve trombositopeni de dahil olmak üzere şiddetli yan etkilere yol açar. Bu nedenle, nampt inhibitörlerinin sistemik uygulanması mümkün değildir12,13,14.
Bu nedenle, burada NAMPT aktivitesinin doğrudan yalıtılmış TANs ‘de engellendiği bir protokol öneriyoruz. Bu tür anti-tümör nötrofiller sonra adoptively bir tümör taşıyan ev sahibi aktarılır. Bu protokol, bileşiklerin sistemik toksik yan etkilerini önlemeye yardımcı olur, ancak hedef hücreler üzerindeki etkisi sürdürülecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerrahi ve farmakolojik kanser tedavisinde ilerlemeye rağmen başarılı tedavi bir zorluk olarak kalır. Bağışıklık hücrelerinin tümör büyümesi düzenlenmesi önemli bir rol oynamak için bilinen bu yana, bu tür hücrelerin tümörleri inhibe yeni yöntemler kurulmalıdır. Burada, Anti-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofillerin evlatlık aktarımı yoluyla tümör büyümesini bastırmak için yeni bir yaklaşım gösteriyoruz. FK866 inhibitörü kullanarak TANs ‘de Pro-anjiyojenik NAMPT sinyallerinin se?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışmalarımız Deutsche Krebshilfe, Grant numarası: 111647 ve Alman Araştırma Konseyi (DFG), Grant numarası: JA 2461/2-1 ‘ den gelen hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
Referencias
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -. F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Investigación sobre el cáncer. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
